Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Toxoplasma gondii er en intracellulær protozo-parasitt som modulerer mikromiljøet til den infiserte verten og er kjent for å være assosiert med forekomsten av hjernesvulstvekst.I denne studien antar vi at eksosomal miRNA-21 fra Toxoplasma-infeksjon fremmer hjernesvulstvekst.Eksosomer fra Toxoplasma-infiserte BV2 mikroglia ble karakterisert og internalisering av U87 gliomceller ble bekreftet.Eksosomale mikroRNA-ekspresjonsprofiler ble analysert ved bruk av arrays av mikroRNA og microRNA-21A-5p assosiert med Toxoplasma gondii og tumorsortering.Vi undersøkte også mRNA-nivåene til tumorassosierte gener i U87-gliomceller ved å endre miR-21-nivåer i eksosomer og effekten av eksosomer på human U87-gliomcelleproliferasjon.I eksosomer av U87 gliomceller infisert med Toxoplasma gondii økes uttrykket av mikroRNA-21 og aktiviteten til antitumorgener (FoxO1, PTEN og PDCD4) reduseres.BV2-avledede eksosomer infisert med Toxoplasma induserer spredning av U87 gliomceller.Eksosomer induserer vekst av U87-celler i en musetumormodell.Vi foreslår at økt exosomal miR-21 i Toxoplasma-infiserte BV2 mikroglia kan spille en viktig rolle som en cellevekstfremmer i U87 gliomceller ved å nedregulere antitumorgener.
Det er anslått at mer enn 18,1 millioner tilfeller av avansert kreft ble diagnostisert over hele verden i 2018, med rundt 297 000 svulster i sentralnervesystemet diagnostisert hvert år (1,6 % av alle svulster)1.Tidligere forskning har vist at risikofaktorer for utvikling av menneskelige hjernesvulster inkluderer ulike kjemiske produkter, familiehistorie og ioniserende stråling fra hodeterapeutisk og diagnostisk utstyr.Den eksakte årsaken til disse malignitetene er imidlertid ukjent.Omtrent 20 % av alle krefttilfeller over hele verden er forårsaket av smittestoffer, inkludert virus, bakterier og parasitter3,4.Smittsomme patogener forstyrrer vertscellens genetiske mekanismer, som DNA-reparasjon og cellesyklus, og kan føre til kroniske betennelser og skader på immunsystemet5.
Infeksiøse midler assosiert med kreft hos mennesker er de vanligste virale patogenene, inkludert humane papillomavirus og hepatitt B- og C-virus.Parasitter kan også spille en potensiell rolle i utviklingen av kreft hos mennesker.Flere parasittarter, nemlig Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis og Hymenolepis nana, har vært involvert i ulike typer kreft hos mennesker 6,7,8.
Toxoplasma gondii er en intracellulær protozo som regulerer mikromiljøet til infiserte vertsceller.Denne parasitten anslås å infisere omtrent 30 % av verdens befolkning, og sette hele befolkningen i fare9,10.Toxoplasma gondii kan infisere vitale organer, inkludert sentralnervesystemet (CNS), og forårsake alvorlige sykdommer som dødelig meningitt og hjernebetennelse, spesielt hos immunkompromitterte pasienter9.Toxoplasma gondii kan imidlertid også endre miljøet til den infiserte verten ved å modulere cellevekst og immunresponser hos immunkompetente individer, noe som fører til opprettholdelse av en asymptomatisk kronisk infeksjon9,11.Interessant nok, gitt korrelasjonen mellom T. gondii-prevalens og hjernesvulstforekomst, antyder noen rapporter at in vivo vertsmiljøendringer på grunn av kronisk T. gondii-infeksjon ligner tumormikromiljøet.
Eksosomer er kjent som intercellulære kommunikatorer som leverer biologisk innhold, inkludert proteiner og nukleinsyrer, fra naboceller16,17.Eksosomer kan påvirke tumorrelaterte biologiske prosesser som anti-apoptose, angiogenese og metastase i tumormikromiljøet.Spesielt miRNA-er (miRNA-er), små ikke-kodende RNA-er med en lengde på omtrent 22 nukleotider, er viktige post-transkripsjonelle genregulatorer som kontrollerer mer enn 30 % av humant mRNA gjennom det miRNA-induserte lyddempingskomplekset (miRISC).Toxoplasma gondii kan forstyrre biologiske prosesser ved å kontrollere miRNA-ekspresjon i infiserte verter.Verts miRNA inneholder viktige signaler for å regulere vertsbiologiske prosesser for å oppnå parasittens overlevelsesstrategi.Å studere endringer i vertens miRNA-profil ved infeksjon med T. gondii kan derfor hjelpe oss å forstå interaksjonen mellom verten og T. gondii klarere.Thirugnanam et al.15 antydet at T. gondii fremmer hjernekarsinogenese ved å endre uttrykket på spesifikke verts-miRNA-er assosiert med tumorvekst og fant at T. gondii kan forårsake gliomer hos forsøksdyr.
Denne studien fokuserer på endringen av eksosomal miR-21 i vertsmikroglia infisert med Toxoplasma BV2.Vi observerte en mulig rolle av endret eksosomal miR-21 i veksten av U87-gliomceller på grunn av retensjonen i kjernen til FoxO1/p27, som er målet for overuttrykt miR-21.
Eksosomer avledet fra BV2 ble oppnådd ved bruk av differensiell sentrifugering og validert ved forskjellige metoder for å forhindre kontaminering med cellulære komponenter eller andre vesikler.SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) viste distinkte mønstre mellom proteiner ekstrahert fra BV2-celler og eksosomer (Figur 1A), og prøver ble vurdert for tilstedeværelse av Alix, som ble analysert ved Western blotting av eksosomale proteinmarkører i .Alix-merking ble funnet i exosomproteiner, men ikke i BV2-cellelysatproteiner (fig. 1B).I tillegg ble renset RNA fra eksosomer avledet fra BV2 analysert ved bruk av en bioanalysator.18S og 28S ribosomale underenheter ble sjelden observert i det eksosomale RNA-migrasjonsmønsteret, noe som indikerer pålitelig renhet (figur 1C).Til slutt viste transmisjonselektronmikroskopi at de observerte eksosomer var omtrent 60–150 nm store og hadde en kopplignende struktur typisk for eksosommorfologi (fig. 1D).
Karakterisering av eksosomer avledet fra BV2-celler.(A) Side med sikkerhetsdatablad.Proteiner ble isolert fra BV2-celler eller eksosomer avledet fra BV2.Proteinmønstre er forskjellige mellom celler og eksosomer.(B) Western blot-analyse av en eksosomal markør (Alix).(C) Evaluering av renset RNA fra BV2-celler og BV2-avledede eksosomer ved bruk av en bioanalyzer.Således ble 18S og 28S ribosomale underenheter i BV2-celler sjelden funnet i eksosomal RNA.(D) Transmisjonselektronmikroskopi viste at eksosomer isolert fra BV2-celler ble negativt farget med 2% uranylacetat.Eksosomer er omtrent 60-150 nm store og koppformede (Song og Jung, upubliserte data).
Cellulær internalisering av BV2-avledede eksosomer i U87 humane gliomceller ble observert ved bruk av konfokal mikroskopi.PKH26-merkede eksosomer er lokalisert i cytoplasmaet til U87-celler.Kjerner ble farget med DAPI (fig. 2A), noe som indikerer at BV2-avledede eksosomer kan internaliseres av vertsceller og påvirke miljøet til mottakerceller.
Internalisering av BV2-avledede eksosomer til U87-gliomceller og BV2-avledede eksosomer infisert med Toxoplasma RH induserte spredning av U87-gliomceller.(A) Eksosomer oppslukt av U87-celler målt ved konfokalmikroskopi.U87 gliomceller ble inkubert med eksosomer merket med PKH26 (rød) eller uten kontroll i 24 timer.Kjernene ble farget med DAPI (blå) og deretter observert under et konfokalt mikroskop (skalastang: 10 μm, x 3000).(B) U87 gliomcelleproliferasjon ble bestemt ved celleproliferasjonsanalyse.U87 gliomceller ble behandlet med eksosomer i den angitte tiden. *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 ved studentens t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 oppnådd ved bruk av Students t-test.
Etter å ha bekreftet internaliseringen av BV2-avledede eksosomer i U87-gliomceller, utførte vi celleproliferasjonsanalyser for å undersøke rollen til BV2-avledede Toxoplasma-avledede eksosomer i utviklingen av humane gliomceller.Behandling av U87-celler med exosomer fra T. gondii-infiserte BV2-celler viste at T. gondii-infiserte BV2-avledede exosomer forårsaket betydelig høyere proliferasjon av U87-celler sammenlignet med kontroll (fig. 2B).
I tillegg hadde vekst av U118-celler de samme resultatene som U87, da Toxoplasma-stimulerte eksosomer forårsaket de høyeste nivåene av spredning (data ikke vist).Basert på disse dataene kan vi indikere at BV2-avledede Toxoplasma-infiserte eksosomer spiller en viktig rolle i gliomcelleproliferasjon.
For å undersøke effekten av Toxoplasma-infiserte BV2-avledede eksosomer på tumorutvikling, injiserte vi U87-gliomceller i nakne mus for en xenograft-modell og injiserte BV2-avledede exosomer eller RH-infiserte BV2-avledede exosomer.Etter at svulster ble synlige etter 1 uke, ble hver forsøksgruppe på 5 mus delt i henhold til tumorstørrelse for å bestemme det samme utgangspunktet, og tumorstørrelse ble målt i 22 dager.
Hos mus med U87 xenograft-modellen ble signifikant større tumorstørrelse og vekt observert i den BV2-avledede RH-infiserte eksosomgruppen på dag 22 (fig. 3A,B).På den annen side var det ingen signifikant forskjell i tumorstørrelse mellom den BV2-avledede eksosomgruppen og kontrollgruppen etter eksosombehandlingen.I tillegg viste mus injisert med gliomceller og eksosomer visuelt det største tumorvolumet i gruppen av RH-infiserte BV2-avledede exosomer (fig. 3C).Disse resultatene viser at BV2-avledede Toxoplasma-infiserte eksosomer induserer gliomvekst i en musetumormodell.
Onkogenese (AC) av BV2-avledede eksosomer i en U87 xenograft musemodell.Tumorstørrelse (A) og vekt (B) ble betydelig økt i BALB/c nakne mus behandlet med RH-infiserte eksosomer avledet fra BV2.BALB/c nakne mus (C) ble injisert subkutant med 1 x 107 U87-celler suspendert i Matrigel-blanding.Seks dager etter injeksjon ble 100 μg BV2-avledede eksosomer behandlet i mus.Tumorstørrelse og vekt ble målt på henholdsvis de angitte dagene og etter avliving. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dataene viste at 37 miRNA (16 overuttrykte og 21 neduttrykte) assosiert med immunitet eller tumorutvikling ble signifikant endret i mikroglia etter infeksjon med Toxoplasma RH-stammen (fig. 4A).Relative ekspresjonsnivåer av miR-21 blant endrede miRNA-er ble bekreftet ved sanntids RT-PCR i eksosomer avledet fra BV2, eksosomer behandlet med BV2- og U87-celler.Ekspresjon av miR-21 viste en signifikant økning i eksosomer fra BV2-celler infisert med Toxoplasma gondii (RH-stamme) (fig. 4B).Relative ekspresjonsnivåer av miR-21 i BV2- og U87-celler økte etter opptak av endrede eksosomer (fig. 4B).De relative nivåene av miR-21-ekspresjon i hjernevevet til tumorpasienter og mus infisert med Toxoplasma gondii (ME49-stamme) var henholdsvis høyere enn i kontrollene (fig. 4C).Disse resultatene korrelerer med forskjeller mellom ekspresjonsnivåene til forutsagte og bekreftede mikroRNAer in vitro og in vivo.
Endringer i uttrykket av eksosomal miP-21a-5p i mikroglia infisert med Toxoplasma gondii (RH).(A) Demonstrerer betydelige endringer i siRNA assosiert med immunitet eller tumorutvikling etter T. gondii RH-infeksjon.(B) Relative miR-21-ekspresjonsnivåer ble oppdaget ved sanntids RT-PCR i BV2-avledede eksosomer, BV2-behandlede exosomer og U87-celler.(C) Relative miR-21-ekspresjonsnivåer ble funnet i hjernevevet til tumorpasienter (N=3) og mus infisert med Toxoplasma gondii (ME49-stamme) (N=3). *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 pluss получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 ble oppnådd ved å bruke Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 oppnådd ved bruk av Students t-test.
Eksosomer fra RH-infiserte BV2-celler førte til vekst av gliomer in vivo og in vitro (fig. 2, 3).For å oppdage relevante mRNA-er undersøkte vi mRNA-nivåer av antitumormålgener, gaffelboks O1 (FoxO1), PTEN og programmert celledød 4 (PDCD4) i U87-celler infisert med eksosomer avledet fra BV2 eller RH BV2.Bioinformatikkanalyse har vist at flere tumorassosierte gener, inkludert FoxO1-, PTEN- og PDCD4-genene, har miR-2121,22-bindingssteder.mRNA-nivåer av antitumormålgener ble redusert i RH-infiserte BV2-avledede eksosomer sammenlignet med BV2-avledede eksosomer (fig. 5A).FoxO1 viste reduserte proteinnivåer i RH-infiserte BV2-avledede eksosomer sammenlignet med BV2-avledede eksosomer (figur 5B).Basert på disse resultatene kunne vi bekrefte at eksosomer avledet fra RH-infisert BV2 nedregulerer anti-onkogene gener, og opprettholder deres rolle i tumorvekst.
Toxoplasma RH-infiserte BV2-avledede eksosomer induserer undertrykkelse av antitumorgener i U87-gliomceller av Toxoplasma RH-infiserte BV2-avledede exosomer.(A) Sanntids-PCR av FoxO1-, PTEN- og PDCD4-ekspresjon i eksosomer avledet fra T. gondii RH-infisert BV2 sammenlignet med PBS-eksosomer.β-aktin mRNA ble brukt som en kontroll.(B) FoxO1-ekspresjon ble bestemt ved Western blotting og densitometridata ble statistisk evaluert ved bruk av ImageJ-programmet. *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 ble oppnådd ved Students t-test. *P < 0,05 pluss получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 ble oppnådd ved å bruke Students t-test. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 oppnådd ved bruk av Students t-test.
For å forstå effekten av miP-21 i eksosomer på tumorassosiert genregulering, ble U87-celler transfektert med en hemmer av miP-21 ved bruk av Lipofectamine 2000 og cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon.FoxO1- og p27-ekspresjonsnivåer i celler transfektert med miR-21-hemmere ble sammenlignet med celler behandlet med BV2-avledede exosomer ved bruk av qRT-PCR (fig. 6A,B).Transfeksjon av miR-21-hemmeren inn i U87-celler nedregulerte FoxO1- og p27-ekspresjonen betydelig (FIG. 6).
RH-infisert exosomal BV2-avledet miP-21 endret FoxO1/p27-ekspresjonen i U87-gliomceller.U87-celler ble transfektert med miP-21-hemmer ved bruk av Lipofectamine 2000 og cellene ble høstet 24 timer etter transfeksjon.FoxO1- og p27-ekspresjonsnivåer i celler transfektert med miR-21-hemmere ble sammenlignet med nivåer i celler behandlet med BV2-avledede eksosomer ved bruk av qRT-PCR (A, B).
For å unnslippe vertens immunrespons, forvandles Toxoplasma-parasitten til en vevscyste.De parasitterer ulike vev, inkludert hjernen, hjertet og skjelettmuskulaturen, gjennom hele vertens levetid og modulerer vertens immunrespons.I tillegg kan de regulere cellesyklusen og apoptose av vertsceller, og fremme deres spredning14,24.Toxoplasma gondii infiserer hovedsakelig vertsdendrittiske celler, nøytrofiler og monocytt/makrofager-avstamning, inkludert hjernemikroglia.Toxoplasma gondii induserer differensiering av makrofager av M2-fenotypen, påvirker sårheling etter patogeninfeksjon, og er også assosiert med hypervaskularisering og granulomatøs fibrose.Denne atferdspatogenesen av Toxoplasma-infeksjon kan være relatert til markører assosiert med tumorutvikling.Det fiendtlige miljøet som reguleres av Toxoplasma kan ligne den tilsvarende precancer.Derfor kan det antas at Toxoplasma-infeksjon bør bidra til utvikling av hjernesvulster.Faktisk er det rapportert om høye forekomster av Toxoplasma-infeksjon i serumet til pasienter med forskjellige hjernesvulster.I tillegg kan Toxoplasma gondii være en annen kreftfremkallende effektor og virke synergistisk for å hjelpe andre smittsomme kreftfremkallende stoffer med å utvikle hjernesvulster.I denne forbindelse er det verdt å merke seg at P. falciparum og Epstein-Barr-virus synergistisk bidrar til dannelsen av Burkitts lymfom.
Eksosomers rolle som regulatorer innen kreftforskning har blitt grundig undersøkt.Imidlertid er rollen til eksosomer mellom parasitter og infiserte verter fortsatt dårlig forstått.Så langt har forskjellige regulatorer, inkludert utskilte proteiner, forklart de biologiske prosessene der protozoiske parasitter motstår vertsangrep og opprettholder infeksjon.Nylig har det vært et voksende konsept at protozoassosierte mikrovesikler og deres mikroRNA-er samhandler med vertsceller for å skape et gunstig miljø for deres overlevelse.Derfor er ytterligere studier nødvendig for å oppdage forholdet mellom endrede eksosomale miRNAer og gliomcelleproliferasjon.MikroRNA-endring (klyngegenene miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 og miR-17-92) binder seg til STAT3-promotoren i toksoplasma-infiserte humane makrofager, er regulert og induserer anti -apoptose som respons på Toxoplasma gondii-infeksjon 29.Toxoplasmainfeksjon øker uttrykket av miR-17-5p og miR-106b-5p, som er assosiert med flere hyperproliferative sykdommer 30 .Disse dataene tyder på at verts-miRNA-er regulert av Toxoplasma-infeksjon er viktige molekyler for parasittoverlevelse og patogenese i vertens biologiske oppførsel.
Endrede miRNA-er kan påvirke ulike typer atferd under initiering og progresjon av ondartede celler, inkludert gliomer: selvforsyning av vekstsignaler, ufølsomhet for veksthemmende signaler, apoptoseunndragelse, ubegrenset replikativt potensial, angiogenese, invasjon og metastaser, og betennelse.I gliom er endrede miRNA-er blitt identifisert i flere ekspresjonsprofileringsstudier.
I denne studien bekreftet vi høye nivåer av miRNA-21-ekspresjon i toksoplasma-infiserte vertsceller.miR-21 har blitt identifisert som en av de hyppigst overuttrykte mikroRNA-ene i solide svulster, inkludert gliomer, 33 og dets uttrykk korrelerer med graden av gliom.Akkumulerende bevis tyder på at miR-21 er et nytt onkogen som fungerer som en anti-apoptotisk faktor i gliomvekst og er sterkt overuttrykt i vev og plasma av maligniteter i menneskelig hjerne.Interessant nok utløser miR-21-inaktivering i gliomceller og vev hemming av celleproliferasjon på grunn av caspaseavhengig apoptose.Bioinformatisk analyse av miR-21 spådde mål avslørte flere tumorsuppressorgener assosiert med apoptoseveier, inkludert programmert celledød 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN og gaffelboks O1 (FoxO1), med miR-2121-bindingsstedet..22.38.
FoxO1, som en av transkripsjonsfaktorene (FoxO), er involvert i utviklingen av ulike typer kreft hos mennesker og kan regulere uttrykket av tumorsuppressorgener som p21, p27, Bim og FasL40.FoxO1 kan binde og aktivere cellesyklushemmere som p27 for å undertrykke cellevekst.Dessuten er FoxO1 en nøkkeleffektor for PI3K/Akt-signalering og regulerer mange biologiske prosesser som cellesyklusprogresjon og celledifferensiering gjennom aktivering av p2742-transkripsjon.
Avslutningsvis tror vi at exosomal miR-21 avledet fra Toxoplasma-infiserte mikroglia kan spille en viktig rolle som vekstregulator av gliomceller (fig. 7).Det er imidlertid behov for ytterligere studier for å finne en direkte sammenheng mellom eksosomal miR-21, endret Toxoplasma-infeksjon og gliomvekst.Disse resultatene forventes å gi et utgangspunkt for å studere sammenhengen mellom Toxoplasma-infeksjon og forekomsten av gliom.
Et skjematisk diagram av mekanismen for gliom (hjerne) karsinogenese er foreslått i denne studien.Forfatteren tegner i PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Alle eksperimentelle protokoller i denne studien, inkludert bruk av dyr, var i samsvar med Seoul National University Animal Care and User Committee Standard Ethical Guidelines og ble godkjent av Institutional Review Board ved Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU- 150715).-2).Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til ARRIVE-anbefalingene.
BV2 musemikroglia og U87 humane gliomceller ble dyrket i henholdsvis Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) og Roswell Park Memorial Institute's Medium (RPMI; Welgene), som hver inneholdt 10 % føtalt bovint serum, 4 mM l- glutamin, 0,2 mM penicillin og 0,05 mM streptomycin.Celler ble dyrket i en inkubator med 5% CO2 ved 37°C.En annen gliomcellelinje, U118, ble brukt for sammenligning med U87-celler.
For å isolere eksosomer fra T. gondii-infiserte RH- og ME49-stammer, ble T. gondii-tachyzoites (RH-stamme) høstet fra bukhulen til 6 uker gamle BALB/c-mus injisert 3-4 dager før.Tachyzoitter ble vasket tre ganger med PBS og renset ved sentrifugering i 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.For å oppnå tachyzoitter av stamme ME49 ble BALB/c-mus injisert intraperitonealt med 20 vevscyster og tachyzoitttransformasjon i cyster ble samlet ved å vaske bukhulen den 6-8 dagen etter infeksjon (PI).Mus infisert med PBS.ME49-tachyzoitter ble dyrket i celler supplert med 100 μg/ml penicillin (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL) og 5% føtalt bovint serum (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) ved 37 °C og 5 % karbondioksid.Etter dyrking i Vero-celler ble ME49-tachyzoitter ført to ganger gjennom en 25 gauge nål og deretter gjennom et 5 µm filter for å fjerne rusk og celler.Etter vasking ble tachyzoittene resuspendert i PBS44.Vevscyster av Toxoplasma gondii-stamme ME49 ble vedlikeholdt ved intraperitoneal injeksjon av cyster isolert fra hjernen til infiserte C57BL/6-mus (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).Hjernen til ME49-infiserte mus ble høstet etter 3 måneder med PI og hakket under et mikroskop for å isolere cyster.De infiserte musene ble holdt under spesielle patogenfrie forhold (SPF) ved Seoul National University School of Medicine.
Totalt RNA ble ekstrahert fra BV2-avledede eksosomer, BV2-celler og vev ved å bruke miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner, inkludert inkubasjonstiden for elueringstrinnet.RNA-konsentrasjonen ble bestemt på et NanoDrop 2000 spektrofotometer.Kvaliteten på RNA-mikroarrayer ble vurdert ved bruk av en Agilent 2100 bioanalyzer (Agilent Technologies, Amstelveen, Nederland).
DMEM med 10 % eksosomfattig FBS ble fremstilt ved ultrasentrifugering ved 100 000 g i 16 timer ved 4°C og filtrert gjennom et 0,22 µm filter (Nalgene, Rochester, NY, USA).BV2-celler, 5 × 105, ble dyrket i DMEM som inneholdt 10 % eksosom-utarmet FBS og 1 % antibiotika ved 37 °C og 5 % CO2.Etter 24 timers inkubering ble tachyzoitter av stamme RH eller ME49 (MOI = 10) tilsatt til cellene og ikke-invaderende parasitter ble fjernet innen en time og fylt på nytt med DMEM.Eksosomer fra BV2-celler ble isolert ved modifisert differensiell sentrifugering, den mest brukte metoden.Resuspender eksosompelleten i 300 µl PBS for RNA- eller proteinanalyse.Konsentrasjonen av isolerte eksosomer ble bestemt ved å bruke et BCA-proteinanalysesett (Pierce, Rockford, IL, USA) og et NanoDrop 2000 spektrofotometer.
Presipitater fra BV2-celler eller eksosomer avledet fra BV2 ble lysert i PRO-PREP™ proteinekstraksjonsløsning (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) og proteiner ble lastet på Coomassie brilliant blue-farget 10% SDS polyakrylamidgeler.I tillegg ble proteiner overført til PVDF-membraner i 2 timer.Western blots ble validert ved å bruke Alix-antistoffet (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) som en eksosomal markør.HRP-konjugert geit anti-mus IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) og en LAS-1000 pluss selvlysende bildeanalysator (Fuji Photographic Film, Tokyo, Japan) ble brukt som et sekundært antistoff..Transmisjonselektronmikroskopi ble utført for å studere størrelsen og morfologien til eksosomer.Eksosomer isolert fra BV2-celler (6,40 µg/µl) ble fremstilt på karbonbelagte masker og negativt farget med 2 % uranylacetat i 1 min.De forberedte prøvene ble observert ved en akselererende spenning på 80 kV ved bruk av en JEOL 1200-EX II (Tokyo, Japan) utstyrt med et ES1000W Erlangshen CCD-kamera (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
BV2-avledede eksosomer ble farget ved bruk av PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i 15 minutter ved romtemperatur.U87-celler, 2×105, med PKH26-merkede eksosomer (røde) eller ingen eksosomer som negativ kontroll, ble inkubert ved 37 °C i 24 timer i en 5 % CO2-inkubator.U87-cellekjerner ble farget med DAPI (blå), U87-celler ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved 4°C og deretter analysert i et Leica TCS SP8 STED CW konfokalmikroskopsystem (Leica Microsystems, Mannheim, Tyskland).observerbar.
cDNA ble syntetisert fra siRNA ved bruk av Mir-X siRNA første trådsyntese og SYBR qRT-PCR-sett (Takara Bio Inc., Shiga, Japan).Kvantitativ PCR i sanntid ble utført ved bruk av iQ5 sanntids PCR-deteksjonssystem (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ved bruk av primere og maler blandet med SYBR Premix.DNA ble amplifisert i 40 sykluser med denaturering ved 95°C i 15 s og annealing ved 60°C i 60 s.Dataene fra hver PCR-reaksjon ble analysert ved å bruke dataanalysemodulen til iQ™5 optisk systemprogramvare (Bio-Rad).Relative endringer i genuttrykk mellom utvalgte målgener og β-aktin/siRNA (og U6) ble beregnet ved bruk av standardkurvemetoden.Primersekvensene som brukes er vist i tabell 1.
3 x 104 U87 gliomceller ble sådd i 96-brønners plater og blandet med Toxoplasma-infiserte eksosomer avledet fra BV2 (50 μg/mL) eller ikke-pulseksosomer avledet fra BV2 (50 μg/ml) som kontroller ved 12, 18 og 36 timer. .Celleproliferasjonshastigheten ble bestemt ved å bruke Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) (tilleggsfigurer S1-S3) 46 .
5 uker gamle BALB/c nakne hunnmus ble kjøpt fra Orient Bio (Seongnam-si, Sør-Korea) og holdt individuelt i sterile bur ved romtemperatur (22±2°C) og fuktighet (45±15°C).%) ved romtemperatur (22±2°C) og fuktighet (45±15%).En 12-timers lyssyklus og en 12-timers mørkesyklus ble utført under SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Mus ble tilfeldig delt inn i tre grupper på 5 mus hver, og alle gruppene ble injisert subkutant med 400 ml PBS inneholdende 1 x 107 U87 gliomceller og vekstfaktor redusert BD Matrigel™ (BD Science, Miami, FL, USA).Seks dager etter tumorinjeksjon ble 200 mg eksosomer avledet fra BV2-celler (med/uten Toxoplasma-infeksjon) injisert på tumorstedet.Tjueto dager etter tumorinfeksjon ble tumorstørrelsen til mus i hver gruppe målt med en skyvelære tre ganger i uken, og tumorvolumet ble beregnet med formelen: 0,5×(bredde)×2×lengde.
MikroRNA-ekspresjonsanalyse ved bruk av miRCURYTM LNA miRNA-array, 7. generasjon har mmu- og rno-matriser (EXIQON, Vedbaek, Danmark) som dekker 1119 velkarakteriserte mus blant 3100 menneske-, mus- og rotte-miRNA-fangstprober.Under denne prosedyren ble 250 til 1000 ng totalt RNA fjernet fra 5'-fosfatet ved behandling med kalve intestinal alkalisk fosfatase etterfulgt av merking med Hy3 grønt fluorescerende fargestoff.De merkede prøvene ble deretter hybridisert ved å laste mikroarray-objektglass ved bruk av et hybridiseringskammersett (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) og et hybridiseringsglasssett (Agilent Technologies).Hybridisering ble utført i 16 timer ved 56°C, deretter ble mikroarrayene vasket i henhold til produsentens anbefalinger.De behandlede mikroarray-lysbildene ble deretter skannet ved å bruke et Agilent G2565CA mikroarray-skannersystem (Agilent Technologies).Skannede bilder ble importert ved hjelp av Agilent Feature Extraction programvareversjon 10.7.3.1 (Agilent Technologies) og fluorescensintensiteten til hvert bilde ble kvantifisert ved å bruke den tilsvarende GAL-filen til den modifiserte Exiqon-protokollen.Microarray-data for den nåværende studien er deponert i GEO-databasen under tilgangsnummer GPL32397.
Ekspresjonsprofiler av modne eksosomale miRNA-er i mikroglia av RH- eller ME49-stammer infisert med Toxoplasma ble analysert ved hjelp av forskjellige nettverksverktøy.miRNA assosiert med tumorutvikling ble identifisert ved hjelp av miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) og filtrert ut med normalisert signalintensitet (log2) større enn 8,0.Blant miRNA-er ble differensielt uttrykte miRNA-er funnet å være mer enn 1,5 ganger endret ved filteranalyse av miRNA-er endret av RH- eller ME49-stammer infisert med T. gondii.
Celler ble sådd i seks-brønns plater (3 x 105 celler/brønn) i opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) ved bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).De transfekterte cellene ble dyrket i 6 timer og deretter ble mediet endret til ferskt komplett medium.Celler ble høstet 24 timer etter transfeksjon.
Statistisk analyse ble hovedsakelig utført ved bruk av Students t-test med Excel-programvare (Microsoft, Washington, DC, USA).For eksperimentell dyreanalyse ble en toveis ANOVA utført ved bruk av Prism 3.0-programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). P-verdier < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante. P-verdier < 0,05 ble sett på som statistisk signifikante. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-verdier <0,05 ble ansett som statistisk signifikante. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P-verdier <0,05 ble ansett som statistisk signifikante.
Alle eksperimentelle protokoller brukt i denne studien ble godkjent av Institutional Review Board ved Seoul National University School of Medicine (IRB-nummer SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Estimert global kreftforekomst og dødelighet i 2018: GLOBOCAN kilder og metoder.Tolkning.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Et innblikk i risikofaktorene for hjernesvulster og deres terapeutiske intervensjoner. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Et innblikk i risikofaktorene for hjernesvulster og deres terapeutiske intervensjoner.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS En gjennomgang av risikofaktorer for hjernesvulster og store terapeutiske intervensjoner. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Dyp forståelse av risikofaktorer for hjernesvulst og terapeutiske intervensjoner.Rashid, S., Rehman, K. og Akash, MS En gjennomgang av risikofaktorer for hjernesvulster og store terapeutiske intervensjoner.Biomedisinsk vitenskap.Farmasøyt.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterielle-virale interaksjoner i kreft i menneskelig fordøyelseskanal og kvinnelige kjønnsorganer: Et sammendrag av epidemiologiske og laboratoriebevis. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterielle-virale interaksjoner i kreft i menneskelig fordøyelseskanal og kvinnelige kjønnsorganer: Et sammendrag av epidemiologiske og laboratoriebevis.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakterielle-virale interaksjoner i kreft i den menneskelige mage-tarmkanalen og kvinnelige kjønnsorganer: et sammendrag av epidemiologiske og laboratoriedata. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Bakterio-viral interaksjon i menneskelig munnhulefordøyelse og kvinnelig reproduksjonskanal: sammendrag av populær sykdomsvitenskap og laboratoriebevis.Kato I., Zhang J. og Sun J. Bakterielle-virale interaksjoner i human gastrointestinal kreft og kvinnelig kjønnskreft: et sammendrag av epidemiologiske og laboratoriedata.Kreft 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Fra infeksjon til kreft: Hvordan DNA-svulstvirus endrer vertscellenes sentrale karbon- og lipidmetabolisme. Magon, KL & Parish, JL Fra infeksjon til kreft: Hvordan DNA-svulstvirus endrer vertscellenes sentrale karbon- og lipidmetabolisme.Mahon, KL og Parish, JL Branninfeksjon til kreft: hvordan DNA-baserte tumorvirus endrer vertscellenes sentrale karbon- og lipidmetabolisme. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质代谢 Magon, KL & Parish, JL Fra infeksjon til kreft: hvordan DNA-svulstvirus endrer vertscellenes sentrale karbon- og lipidmetabolisme.Mahon, KL og Parish, JL Brenner infeksjon til kreft: hvordan DNA-svulstvirus endrer sentral karbon- og lipidmetabolisme i vertsceller.Åpen biologi.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Katekoløstrogener av schistosomer og leversår og helminth-assosiert kreft.front.varmt inni.5, 444 (2014).