Giardia duodenum er en parasittisk organisme som forårsaker giardiasis, en tarminfeksjon spesielt vanlig hos små barn med kliniske tegn på diaré.Vi har tidligere rapportert at ekstracellulær G. duodenalis utløser aktivering av intracellulær oligomeriseringslignende reseptor 3 (NLRP3) bindende nukleotider og regulerer vertsinflammatoriske responser gjennom ekstracellulær vesikkel (EV) sekresjon.Imidlertid gjenstår de eksakte molekylære mønstrene til den patogenassosierte duodenokokken EV (GEV) involvert i denne prosessen og rollen til NLRP3-inflammasomet i giardiasis å bli belyst.
Rekombinante eukaryote ekspresjonsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardiner i GEV ble konstruert, transfektert inn i primære peritoneale makrofager fra mus og påvist ved å måle inflammasjonsmålmolekylet caspase-1.p20-ekspresjonsnivået ble screenet..G. duodenalis alfa-2 og alfa-7.3 giardiner ble opprinnelig identifisert ved å måle NLRP3 inflammasom (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 og caspase-1 p20), IL-sekresjon.1β-nivåer, apoptotisk flekket protein (ASC) oligomeriseringsnivåer og immunfluorescerende lokalisering av NLRP3 og ASC.Rollen til NLRP3-inflammasomet i patogenisiteten til G. duodenalis ble deretter vurdert ved bruk av mus der NLRP3-aktivering var blokkert (NLRP3-blokkerte mus) og patologiske endringer i kroppsvekt, duodenal parasittisk belastning og duodenalt vev ble overvåket.I tillegg undersøkte vi om hiardiner alfa-2 og alfa-7.3 induserer IL-1β-sekresjon in vivo via NLRP3-inflammasomet og bestemte rollen til disse molekylene i patogenisiteten til G. duodenalis hos mus.
Alfa-2- og alfa-7.3-giardiner induserer aktiveringen av NLRP3-inflammasomet in vitro.Dette førte til aktivering av p20 caspase-1, en økning i ekspresjonsnivåene av NLRP3, pro-IL-1β og pro-caspase-1 proteiner, en signifikant økning i IL-1β sekresjon, dannelse av ASA flekker i cytoplasma og induksjon av ASA-oligomerisering.NLRP3-betennelse Peniltap forverrer patogenisiteten til G. duodenalis hos mus.Mus behandlet med cyster ved sonde fra NLRP3-blokkerte mus viste et økt antall trofozoitter og alvorlig skade på duodenal villi, preget av nekrotiske krypter med krympede og forgrenede.In vivo-eksperimenter har vist at giardiner alfa-2 og alfa-7.3 kan indusere sekresjon av IL-1β via NLRP3-inflammasomet, og immunisering med giardiner alfa-2 og alfa-7.3 reduserte patogenisiteten til G. duodenalis hos mus.
Samlet tyder resultatene av denne studien på at giardia alfa-2 og alfa-7.3 forårsaker oppregulering av verts NLRP3-betennelse og reduserer smitteevnen til G. duodenalis hos mus, som er lovende mål for å forhindre giardiasis.
Giardia duodenum er en ekstracellulær protozo-parasitt som lever i tynntarmen og forårsaker 280 millioner tilfeller av giardiasis med diaré årlig, spesielt blant små barn i utviklingsland [1].Folk blir smittet av drikkevann eller mat som er forurenset med M. duodenum-cyster, som deretter kommer inn i magen og skilles ut i magesaften.Giardia duodenum trophozoites fester seg til epitelet i tolvfingertarmen, og forårsaker kvalme, oppkast, diaré, magesmerter og vekttap.Personer med immunsvikt og cystisk fibrose er utsatt for infeksjon.Infeksjon kan også skje ved oral og analsex [2].Legemidler som metronidazol, tinidazol og nitazoxanid er de foretrukne behandlingsalternativene for duodenale infeksjoner [3].Imidlertid forårsaker disse kjemoterapimedikamentene uønskede bivirkninger som kvalme, karsinogenese og genotoksisitet [4].Derfor må det utvikles mer effektive strategier for å forhindre G. duodenalis-infeksjon.
Inflammasomer er en klasse av cytosoliske proteinkomplekser som er en del av den medfødte immunresponsen, som bidrar til å forsvare seg mot patogeninvasjon og mediere inflammatoriske responser [5].Blant disse inflammasomene er nukleotidbindende oligomerisering (NOD) reseptor 3 (NLRP3) nukleotidbindende oligomerisering (NLRP3) nukleotidbindende-lignende inflammasom blitt grundig studert fordi det kan påvises av forskjellige patogen-/skadeassosierte molekylære mønstre (PAMP/ DAMP), gjenkjenner, aktiverer det medfødte immunsystemet.og regulerer intestinal homeostase ved mange inflammatoriske sykdommer [6,7,8].Den består av mønstergjenkjenningsreseptoren (PRR) NLRP3, et adapter apoptotisk spotted protein (ASC), og en effektor procaspase-1 eller procaspase-11.NLRP3-inflammasomet fungerer som en vert mot patogeninvasjon, som observert i Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] og Leishmania-studier.[11], men det har også blitt rapportert at aktivering av NLRP3-inflammasomet begrenser beskyttende immunresponser og forverrer sykdomsprogresjonen, for eksempel hos ormer [12].Basert på våre tidligere funn rapporterte vi at ekstracellulær G. duodenalis utløser intracellulær aktivering av NLRP3-inflammasjon og modulerer vertsinflammatoriske responser ved å utskille ekstracellulære vesikler (EVs) [13].Rollen til NLRP3-inflammasomet i G. duodenalis-infeksjon in vivo gjenstår imidlertid å bestemme.
Giardiner ble opprinnelig beskrevet som strukturelle komponenter av G. duodenalis cytoskjelettet og spiller en viktig rolle i trofozoittmotilitet og epitelcellefeste i tynntarmen.For å bedre tilpasse seg miljøet og øke deres patogenisitet utviklet G. duodenalis trophozoites en unik cytoskelettstruktur bestående av 8 flageller, 1 mellomkropp og 1 ventralskive [14].Trofozoittene til Giardia duodenum bruker cytoskjelettet til å penetrere den øvre tynntarmen, spesielt tolvfingertarmen, og feste seg til enterocytter.De migrerer konstant og fester seg til epitelceller ved hjelp av cellemetabolisme.Derfor er det et nært forhold mellom deres cytoskjelett og virulens.Giardiner spesifikke for Giardia duodenum er komponenter i cytoskjelettstrukturen [15] og er delt inn i fire klasser: α-, β-, γ- og δ-giardiner.Det er 21 medlemmer av α-giardin-familien, som alle har en kalsiumavhengig evne til å binde fosfolipider [16].De kobler også cytoskjelettet til cellemembranen.Hos individer med diaré forårsaket av G. duodenalis er α-giardiner sterkt uttrykt og immunreaktivt under infeksjon [17].Heterologe vaksiner basert på Giardia alfa-1 beskyttet mot giardiasis hos mus og er potensielle kandidatantigener for vaksineutvikling [18].Alfa-8 giardin, lokalisert i plasmamembranen og flagellene, men ikke i den ventrale skiven, øker motiliteten og veksthastigheten til trofozoitter i G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin fester seg til mikrotubulusstrukturer på flageller og påvirker levedyktigheten til G. duodenalis [20].Alfa-11-giardin er tilstede i overflod gjennom hele livssyklusen, og overekspresjon av alfa-11-giardin skader selve G. duodenalis [21].Det er imidlertid uklart om alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin er beskyttende mot G. duodenalis-infeksjon og deres underliggende mekanismer.
I denne studien ble rekombinante eukaryote ekspresjonsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin transfektert inn i primære peritoneale makrofager fra mus for å aktivere vert NLRP3.Inflammasomiske mål ble deretter screenet.Vi vurderte også rollen til NLRP3-inflammasomet i patogenisiteten til G. duodenalis, undersøkte om alfa-2- og alfa-7,3-giardiner induserer aktivering av NLRP3-inflammasomet in vivo, og fastslo at disse to rollene til giardiner i patogenisiteten til G. duodenalis.Vårt felles mål var å utvikle lovende mål for forebygging av G. duodenalis-infeksjon.
Villtype (WT) C57BL/6 hunnmus i alderen 5–8 uker ble kjøpt fra Liaoning Changsheng Experimental Animal Center (Liaoning, Kina).Mus hadde fri tilgang til vann, fikk sterilisert mat og ble holdt i en 12/12 timers lys/mørke syklus.Før infeksjon fikk mus antibiotika ad libitum i drikkevann supplert med ampicillin (1 mg/ml), vankomycin (1 mg/ml) og neomycin (1,4 mg/ml) (alle kjøpt fra Shanghai, Kina, kunstige organismer) [22 ].].Mus som mistet evnen til å spise og drikke i > 24 timer og mistet ≥ 20 % kroppsvekt ble humant avlivet ved cervikal dislokasjon.
WB G. duodenalis trophozoites (American Type Culture Collection, Manassas, USA) ble supplert med 12,5 % føtalt bovint serum (FBS; Every Green, Zhejiang, Kina) og 0,1 % bovin galle (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA) ).USA) under mikroaerobe forhold.Sammenflytende trofozoitter ble samlet på is og passert i et forhold på 1:4 for videre reproduksjon.
Giardia duodenum-cyster ble indusert som beskrevet tidligere [23], trofozoitter ble høstet i logaritmisk fase og deretter fortynnet med innkapslingsinduserende medium, pH 7,1 (modifisert TYI-S-33) til en sluttkonsentrasjon på 1 × 106 trofozoitter/ml.gallekonsentrasjon 0,05 % medium).Trofozoitter ble dyrket under anaerobe forhold ved 37°C inntil den logaritmiske vekstfasen.Bytt mediet til cyste-induserende medium (pH 7,8; ​​modifisert TYI-S-33-medium med 1 % gallekonsentrasjon) og dyrk G. duodenalis ved 37 °C i 48–96 timer, hvor dannelsescystene ble observert under et mikroskop.Etter at de fleste av trofozoittene hadde blitt indusert til å danne cyster, ble kulturblandingen høstet og resuspendert i sterilt avionisert vann for å lysere de gjenværende trofozoittene.Cyster ble talt og lagret ved 4°C for påfølgende analyser gjennom et magesonde hos mus.
Giardia ekstracellulære vesikler (GEVs) ble beriket som beskrevet tidligere [13].Trofozoitter i logaritmisk vekstfase ble resuspendert i modifisert TYI-S-33-medium tilberedt med eksosom-utarmet FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel) til en sluttkonsentrasjon på 1 × 106 parasitter/ml og inkubert i 12 timer.ble isolert fra kultursupernatanten ved sentrifugering ved 2000 g i 10 minutter, 10.000 g i 45 minutter og 100.000 g i 60 minutter.Presipitater ble oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS), kvantifisert ved bruk av et BCA-proteinanalysesett (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) og lagret ved -80°C eller brukt direkte for videre analyser.
Primære muse peritoneale makrofager ble fremstilt som beskrevet tidligere [24].Kort fortalt ble mus (i alderen 6-8 uker) injisert (intraperitonealt [ip]) med 2,5 ml 2,98 % Difco flytende tioglykolmedium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) og matet med 3-4 ganer.En suspensjon av makrofager ble samlet fra bukhulen til mus etter eutanasi og sentrifugert 3 ganger ved 1000 g i 10 minutter.Høstede celler ble detektert ved flowcytometri ved bruk av CD11b-markøren inntil cellens renhet var >98 %, deretter tilsatt til 6-brønners cellekulturplater (4,5 x 106 celler/brønn) og inkubert med 10 % FBS (Bioindustri) ved 37 °C.og 5 % CO2.
RNA ble ekstrahert fra 1 × 107 trofozoitter i 1 ml TRIzol-reagens (Vazyme, Nanjing, Kina), genomisk DNA ble ekstrahert fra totalt G. duodenalis RNA ved bruk av MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Kina) og komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert ved å bruke MonScript RTIIII Super Mix (Monad) i henhold til produsentens instruksjoner.
CDS-sekvensinformasjon for mål-G. duodenalis-genet ble hentet fra NCBI GenBank.Bruk Primer 5.0 til å designe spesifikke sømløse kloningsprimere for hvert målgen.Foroverprimeren (5′-3′) består av tre deler: en overlappende sekvens med en linearisert vektor pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) og startkodonene ATG og GNN (hvis den første basen ikke er G).Dette gjøres for å forbedre effektiviteten til uttrykket.I tillegg minst 16 bp kombinerte baser (GC-innhold 40–60 %/Tm ca. 55 °C).Den reverse primeren (5′-3′) består av to deler, en overlappende sekvens med en EcoRV-linearisert vektor pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) og en kombinert base på minst 16 bp.(unntatt de to siste holdeplassene).baser) et kodon slik som AA eller GA for å tillate rekombinante plasmider å uttrykke deres merkede proteiner).Primersekvensene er oppført i tabell 1 og ble syntetisert av Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Kina).
Mål ble amplifisert ved å bruke Pfu DNA-polymerase (Tiangen, Beijing, Kina) eller Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, Kina) ved å bruke forberedt G. duodenalis cDNA som en mal.Det eukaryote ekspresjonsvektorplasmidet pcDNA3.1(+) ble linearisert med restriksjonsenzymet EcoRV og defosforylert ved bruk av Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Lineariserte pcDNA3.1(+)-fragmenter og amplifiserte målgenfragmenter ble renset ved bruk av et DNA-gelrensesett (Tiangen) og kvantifisert ved bruk av en Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1(+)-fragmentet og hvert målgenfragment ble rekombinert ved bruk av MonClone enkeltmonteringskloningsblanding (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, Kina) og bekreftet ved DNA-sekvensering ved bruk av Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Kina)..
Endotoksinfrie plasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ble generert ved bruk av SanPrep Endotoxin-free Plasmid Mini Kit (Sangon Biotech).Konsentrasjonen ble holdt over 500 ng/µl for å sikre at EDTA i elueringsbufferen ikke forstyrret transfeksjonsanalysen.Primære muse peritoneale makrofager ble dyrket i 6-brønns plater med komplett RPMI 1640 medium (Biological Industries) i 12 timer, deretter ble cellene vasket 3 ganger i varm PBS for å fjerne penicillin og streptomycin, og deretter i medium supplert med komplett medium.Endotoksinfrie plasmider pcDNA3.1(+)-alpha-2 og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) ble fortynnet i 125 μl Opti-MEM redusert serummedium (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Deretter ble 5 µl Lipofectamine 2000 transfeksjonsreagens (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) fortynnet i 125 µl lavserum Opti-MEM-medium.Forbered liposom-DNA-komplekser ved å blande det fortynnede endotoksinfrie plasmidet med Lipofectamine 2000 og la blandingen stå ved romtemperatur i 5 minutter.Overfør kompleksene separat til celler i hver brønn og bland sakte.Etter 4 timer ble cellekulturmediet erstattet med 2 ml komplett RPMI 1640-medium og dyrkingen ble fortsatt i 24 timer.Ferskt cellekulturmedium ble tilsatt til cellene og inkubert i forskjellige tidspunkter avhengig av analysedesignet.
Proteinprøver fra supernatanter og cellelysater ble fremstilt som beskrevet tidligere [25].Membranoverføringsparametere for pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin og His-tag var 200 mA/90 min.For interleukin 1β (IL-1β; R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, Sveits) og NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, Sveits) og 1:5000 rettet mot His tag ( Amylet Scientific, Wuhan, Kina) og β-aktin (Proteintech, Wuhan, Kina).
Tverrbinding med disuccinimidsuberat (DSS) ble utført som beskrevet tidligere [26].Celler ble vasket 3 ganger med kald PBS og fullstendig lysert med en 27 gauge nål i 50 ul ASC reaksjonsbuffer (pH 8,0) inneholdende 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES og 125 mM NaHC03.Blandingen ble sentrifugert ved 5000 g i 3 minutter og pelleten ble suturert med 10 ul DSS (25 mM i DMSO) og 40 ul ASC-reaksjonsbuffer i 30 minutter ved 37°C.Etter sentrifugering ved 5000 g i 10 minutter ble pelleten oppløst i en løsning av 40 µl ASC-reaksjonsbuffer og 10 µl 6x proteinbelastningsbuffer (TransGen, Beijing, Kina), og deretter ble løsningen bråkjølt ved romtemperatur i 15 min., Kok deretter 10 minutter.Proteinprøver ble deretter utsatt for Western blotting ved bruk av primære anti-ASC-antistoffer (Wanleibio, Shenyang, Kina) i et fortynningsforhold på 1:500.
Etter en tidligere beskrevet prosedyre [13] ble cellekultursupernatanter høstet og sekresjon av det pro-inflammatoriske cytokinet IL-1β ble bestemt ved bruk av muse IL-1 Beta ELISA-settet (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konverter OD450nm-verdier til proteinkonsentrasjoner ved å bruke IL-1β-standardkurven.
Celler belagt på dekkglass ble forsiktig vasket 3 ganger i varm PBS, fiksert i vevscellefiksativ (Biosharp, Beijing, Kina) i 10 minutter ved romtemperatur (RT), i 0,1 % Triton X-Permeabilize ved 100 (fortynnet i PBS; Biosharp) ) i 20 minutter ved romtemperatur og blokker inn 5 % bovint serumalbumin (i PBS) i 2 timer ved romtemperatur.Celler ble deretter inkubert over natten ved 4°C med primære antistoffer mot henholdsvis ASC (1:100 fortynning) eller NLRP3 (1:100 fortynning), og Cy3-merket geit-anti-kanin IgG(H+L) (1:400; EarthOx) , San Francisco, CA, USA) eller FITC-konjugert geit-anti-mus IgG (1:400; Earthox) over natten ved 37 °C i mørket i 1 time.Kjernene ble farget med Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Kina) i 5 minutter og observert under et fluorescensmikroskop (Olympus Corporation, Tokyo, Japan).
Mus ble delt inn i fire grupper (n = 7 i hver gruppe): (i) PBS-behandlet negativ kontrollgruppe (kun PBS; sonde 100 µl/mus PBS etterfulgt av daglig intraperitoneal injeksjon 100 µl/mus PBS 3 timer senere)., kontinuerlig i 7 dager);(ii) negativ kontrollgruppe behandlet med MCC950-hemmer [27] (100 µl/mus via PBS sonde, 3 timer senere, 10 mg/kg kroppsvekt [BW] MCC950 [i PBS] ble administrert intraperitonealt daglig, varighet 7 dager);(iii) G. duodenalis cysteinfeksjonsgruppe (1,5 x 106 cyster/mus ved sondemating, 3 timer senere, 100 μl/mus PBS intraperitonealt administrert daglig i 7 dager);(iv) G. duodenalis cyste kombinert infeksjonsgruppe MCC950-hemmerbehandlingsgruppe (1,5×106 cyster/mus via sonde, 10 mg/kg kroppsvekt MCC950 intraperitonealt daglig i 7 dager ved 3 timer).Kroppsvekten til hver mus ble overvåket daglig og alle mus ble avlivet på den 7. dagen.Innhøstet duodenum (3 cm lang) ble kuttet i små biter i 1 ml PBS, cyster ble ødelagt over natten i PBS ved 4°C, og G. duodenalis trophozoites.Frisk duodenum (1 cm lang) ble isolert for hematoxylin og eosin (H&E)-farging.
Mus ble delt inn i to grupper: (i) MOCK-kontrollgruppe og (ii) MCC950-hemmergruppe.Det var fem behandlinger i hver gruppe (n = 7/behandlingsgruppe): (i) PBS-behandling negativ kontrollgruppe (kun PBS; 100 µl/mus PBS, intramuskulær (IM) injeksjon (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) pcDNA3.1(+) plasmid negativ kontrollgruppe (100 µg/muse-DNA, via intramuskulær injeksjon) (iii) G. duodenalis cysteinfeksjon positiv kontrollgruppe (1,5 x 106 cyster/mus, via sonde) (iv) a); gruppe behandlet med plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-2 (100 μg/muse-DNA, ved intramuskulær injeksjon), og (v) en gruppe behandlet med plasmid pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 (100 µg/mus) DNA, etter 12 timers passasje, fikk mus i MCC950-hemmergruppen en daglig intraperitoneal injeksjon av MCC950 (10 mg/kg kroppsvekt) i 7 dager, mens mus i MOCK-gruppen fikk et like stort volum PBS-behandling. Blodprøver ble samlet fra øyeeplemusene og forlatt over natten ved 4 °C Serumprøver ble isolert ved bruk av enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA) for og målinger av IL-1β-nivåer.
Trettifem mus ble delt inn i fem grupper (n=7/gruppe).Gruppe 1 var en negativ kontrollgruppe behandlet med PBS: mus fikk 100 μl PBS intramuskulært og 3 dager senere med sonde.Gruppe 2 er en positiv kontrollgruppe infisert med G. duodenalis-cyster: mus ble injisert med 100 μl PBS, og 3 dager senere ble 1,5 x 106 cyster/mus injisert intragastrisk.Tredje gruppe – plasmidimmunisering med pcDNA3.1(+) i kombinasjon med kontrollgruppe for duodenal cysteinfeksjon: mus fikk 100 μg plasmid-DNA pcDNA3.1(+)(im) oralt, 1,5×106 cyster/mus 3 for flere dager.Gruppe 4 og 5 var rekombinant pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardinplasmid eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardinplasmid i kombinasjon med G. duodenalis cysteinfeksjon.Eksperimentell gruppe: mus mottok 100 µg pcDNA3.1(+)-giardin plasmid DNA (im), deretter 3 dager senere ble 1,5 × 106 cyster/mus injisert via sonde.Kroppsvekten til hver mus ble overvåket etter introduksjonen av G. duodenalis-cysten gjennom røret.Frisk tolvfingertarm ble samlet inn for parasittiske belastningsmålinger og HE-fargingsanalyse.
Histopatologiske endringer ble analysert i henhold til en tidligere publisert prosedyre [30].Frisk duodenum ble fiksert med vevscellefiksativ, innebygd i parafin, kuttet i 4 μm seksjoner, farget med H&E og analysert under et lysmikroskop.Representative patologiske endringer i syv vevssnitt fra syv uavhengige mus ble evaluert av en patolog som ikke var klar over behandlingen og ble fanget ved 200x forstørrelse.Lengden på villi og dybden av kryptene ble målt i samsvar med de tidligere beskrevne metodene.
Resultatene in vitro og in vivo ble oppnådd i tre eksemplarer.Grafer ble generert ved bruk av GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Forskjeller mellom to grupper ble analysert ved t-test, mens forskjeller mellom ≥3 grupper ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av SPSS-programvare (versjon 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Data ble analysert for varianshomogenitet ved bruk av Levenes test etterfulgt av Bonferronis post hoc test (B).Signifikans er uttrykt som P<0,05, P<0,01 og P<0,001 (ikke signifikant [ns]) (P>0,05).
Vår tidligere analyse av GEV-proteomikk i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) viste at mange mål kan være involvert i aktiveringen av inflammatoriske signalveier [13].Vi valgte ut to lovende mål, alfa-2 og alfa-7.3 giardiner, forsterker disse molekylene og bruker dem til å konstruere den eukaryote ekspresjonsvektoren pcDNA3.1(+).Etter sekvensering ble rekombinante pcDNA3.1(+)-alfa-2- og alfa-7.3-giardin-ekspresjonsplasmider transfektert inn i primære muse-peritoneale makrofager, og caspase-1 p20-signaturproteinet for inflammasjon (et fragment av aktivert caspase-1) ble identifisert som å belyse nøkkelmolekyler som kan utløse betennelse.Resultatene viste at alfa-2 og alfa-7.3 giardiner kan indusere p20 caspase-1 uttrykk som ligner på GEV.Ingen effekt på kaspase-1-aktivering ble funnet i den ubehandlede negative kontrollen (kun PBS) og plasmidkontrollen pcDNA3.1(+) (figur 1).
Måling av p20 caspase-1 aktivering ved pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardiner.Rekombinante eukaryote ekspresjonsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2 og alfa-7.3 giardiner (over hver bane) ble transfektert inn i primære muse peritoneale makrofager og kultursupernatanter ble høstet 24 timer senere.Western blotting ble brukt for å måle ekspresjonsnivåer av signatur caspase-1 p20 inflammasomproteinet.Den eneste PBS-behandlingsgruppen (felt C) og pcDNA3.1(+) monoterapigruppen (pcDNA3.1-bane) ble brukt som negativ kontroll, og GEV-behandlingsgruppen ble brukt som positiv kontroll.Ekspresjon av det rekombinante proteinet ble bekreftet ved å påvise et histidinmerke i hvert protein, og de forventede proteinbåndene var alfa-2-giardin (38,2 kDa) og alfa-7,3-giardin (37,2 kDa).GEV, Giardia duodenum ekstracellulære vesikler, pcDNA3.1(+), EcoRV-linearisert vektor, SUP, supernatant
For å bestemme om alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin induserer p20 caspase-1-ekspresjon og spiller en rolle i aktivering av vertens NLRP3-inflammatoriske respons, pcDNA3.1(+)-alpha-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alpha -7,3 giardin ble transfektert inn i primære muse peritoneale makrofager med rekombinant plasmid DNA, og nivåer av ekspresjon, lokalisering og oligomerisering av de viktigste inflammatoriske proteinene NLRP3 ble bestemt.I dette eksperimentet ble GEV brukt som den positive kontrollgruppen, og gruppen uten behandling (kun PBS) eller pcDNA3.1(+) transfeksjonsbehandlingsgruppen var den negative gruppen.Resultatene viste at, som i GEV-gruppen, resulterte rekombinant plasmid-DNA av giardin pcDNA3.1(+)-alfa-2 og giardin pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 i oppregulering av NLRP3, pro-IL-1β og procaspase-1 og caspase-1 aktivering (fig. 2a).I tillegg induserte begge giardinene signifikant IL-1β-sekresjon (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2-giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (Figur 2b).De fleste ASC-proteiner var monomere i gruppen uten behandling eller i behandlingsgruppen transfektert med pcDNA3.1(+)-plasmidet, i motsetning til pcDNA3.1(+)-alfa-2 eller pcDNA3.1(+)-alfa- 7,3 giardine.ASC-oligomerisering skjedde i det rekombinante plasmid-DNAet til den GEV-positive kontrollgruppen eller gruppen, og viste en oligomer form (figur 2c).Disse foreløpige dataene tyder på at alfa-2-giardin og alfa-7,3-giardin kan indusere NLRP3-inflammasjonsaktivering.Påfølgende immunfluorescerende studier av lokaliseringen av ASC og NLRP3 viste at i den negative kontrollgruppen ble ASC-proteinet spredt over hele cytoplasmaet og dukket opp som et punktsignal ved stimulering av pcDNA3.1(+)-alfa-2 med giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7,3-giardingruppe eller GEV-positiv kontrollgruppe (figur 2d).I den negative kontrollen og plasmid-behandlede pcDNA 3.1-gruppene ble ikke NLRP3-proteinsignalet påvist, mens en fluorescerende signalprikk som respons på pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 ble oppdaget..giardin finnes i cytoplasmaet eller ved stimulering av HEV (fig. 2e).Disse dataene viser videre at G. duodenalis giardin alfa-2 og giardin alfa-7.3 aktiverer NLRP3-inflammasomet i primære peritoneale makrofager fra mus.
pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin aktiverer NLRP3-inflammasomet i peritoneale makrofager fra mus.Transfekter de rekombinante eukaryote ekspresjonsplasmidene pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin inn i primære murine peritoneale makrofager og celler, eller høst supernatanten innen 24 timer for analyse av ekspresjon, oligomerisering , sekresjon.og lokalisering av viktige inflammatoriske proteiner.Bare PBS-gruppen (C) og enkeltbehandlingsgruppen pcDNA3.1(+) ble brukt som negativ kontroll, og GEV-behandlingsgruppen ble brukt som positiv gruppe.a Nøkkelinflammatoriske proteiner NLRP3, inkludert NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1 og p20 caspase-1, ble påvist ved Western blotting.b Nivåene av sekresjon av IL-1β i supernatantene ble bestemt ved bruk av enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA).Forskjeller mellom kontroll- og eksperimentelle grupper ble analysert ved enveis variansanalyse (ANOVA) ved bruk av SPSS-programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom gruppene **P<0,01 og ***P<0,001.c ASC-oligomeriseringsnivåer i pellets ble bestemt ved DSS-tverrbindingsanalyse, mens ASC-nivåer i cellelysater ble brukt som belastningskontroll.d Visualisering av ISC-lokalisering ved bruk av immunfluorescens.e Immunfluorescens ble brukt for å visualisere lokaliseringen av NLRP3.ASC, apoptotisk flekklignende protein;IL, interleukin;NLRP3, nukleotidbindende oligomeriseringslignende reseptor 3;ns, ikke signifikant (P > 0,05)
Både G. duodenalis og GEV-ene den utskiller aktiverer NLRP3-inflammasomet og regulerer vertens inflammatoriske responser in vitro.Dermed er rollen til NLRP3-inflammasomet i patogenisiteten til G. duodenalis fortsatt uklar.For å undersøke dette problemet designet vi et eksperiment mellom mus infisert med G. duodenalis-cyste og mus infisert med G. duodenalis-cyste + MCC950-hemmerbehandling og sammenlignet NLRP3-inflammasomuttrykk når de ble infisert med G. duodenalis-cyste.Et detaljert skjema for eksperimentet er vist i fig. 3a.Endringer i kroppsvekt til mus i forskjellige behandlingsgrupper ble overvåket i 7 dager etter infeksjon med cyster, og resultatene er vist i fig. 3b.Sammenlignet med gruppen behandlet med ren PBS, viste resultatene at (i) kroppsvekten til mus infisert med G. duodenalis cyste sank fra dag 3 til dag 7 etter infeksjon;(ii) behandling med MCC950-hemmeren hadde ingen signifikant effekt på kroppsvekten til musene..Sammenlignet med enkeltinfeksjonsgruppen sank BW for duodenalinfeksjonsgruppen behandlet med MCC950 i varierende grad (Dag 1: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; Dag 2: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001; Dag 3: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010; (3, 24)=0,6497, P=0,0645; Dag 6: ANOVA, F(3, 24)=5,457, P=0,0175;Disse dataene viser at NLRP3-inflammasomet beskytter mus mot betydelig vekttap i de tidlige stadiene (2-4 dager) av duodenal infeksjon.Vi hadde deretter som mål å oppdage G. duodenalis trofozoitter i duodenal lavagevæske og resultatene er vist i figur 3c.Sammenlignet med G. duodenalis cysteinfeksjonsgruppen økte antall trofozoitter i duodenum signifikant etter blokkering av NLRP3-inflammasomet (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Duodenalt vev farget med HE viste, sammenlignet med negativ kontroll behandlet med PBS og MCC950 alene: (i) G. duodenalis cysteinfeksjon resulterte i skade på duodenal villi (ANOVA, F(3, 24)=0,4903, P= 0,0488 ) og kryptatrofi (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) duodenum fra mus infisert med G. duodenalis-cyster og behandlet med MCC950-hemmere.duodenal villi var skadet og døde (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) med atrofi og kryptforgrening (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Disse resultatene tyder på at NLRP3-inflammasomet spiller en rolle i å redusere patogenisiteten til G. duodenalis.
Rollen til NLRP3-inflammasom i Giardia duodenuminfeksjon.Mus ble gitt sonde (iv) med duodenokokkcyster og deretter behandlet med eller uten MCC950 (ip).Enkeltbehandlingsgrupper med PBS eller MCC950 ble brukt som kontroller.Eksperimentell gruppe og behandlingsregime.b Kroppsvekten til mus i hver av de forskjellige behandlingsgruppene ble overvåket i 7 dager.Forskjellen mellom G. duodenalis-infeksjonsgruppen og G. duodenalis + MCC950-infeksjonsbehandlingsgruppen ble analysert ved t-test ved bruk av SPSS-programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller ved *P<0,05, **P<0,01 eller ***P<0,001.c Parasittisk belastning ble bestemt ved å telle antall trofozoitter i duodenal lavagevæske.Forskjellen mellom G. duodenalis-infeksjonsgruppen og G. duodenalis + MCC950-infeksjonsbehandlingsgruppen ble analysert ved t-test ved bruk av SPSS-programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller ved *P < 0,05.d Hematoksylin og eosin (H&E) farging resultater av duodenal histopatologi.Røde piler indikerer skade på villi, grønne piler indikerer skade på kryptene.Målestokk: 100 µm.e, f Statistisk analyse av duodenal villus høyde og musekrypthøyde.Stjerner indikerer signifikante forskjeller ved *P<0,05 og **P<0,01.Resultatene er hentet fra 7 uavhengige biologiske eksperimenter.BW, kroppsvekt;ig, intragastrisk leveringsvei;ip, intraperitoneal leveringsvei;ns, ikke signifikant (P > 0,05);PBS, fosfatbufret saltvann;WT, villtype
Sekresjonen av IL-1β er et kjennetegn på betennelsesaktivering.For å bestemme om G. duodenalis alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin aktiverer NLRP3-vertsinflammasomet in vivo, brukte vi ubehandlede WT-mus (sham-gruppe) og NLRP3-inflammasomblokkerte mus (MCC950-hemmet behandlingsgruppe).Et detaljert skjema for eksperimentet er vist i fig. 4a.Eksperimentelle grupper besto av mus behandlet med PBS, G. duodenalis cystebehandling ved sondemating, intramuskulær injeksjon av pcDNA3.1 og intramuskulær injeksjon av pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin.På den 7. dagen etter intramuskulær administrering av det rekombinante plasmidet ble serum samlet og nivået av IL-1β i hver gruppe ble bestemt.Som vist i figur 4b, i MOCK-gruppen: (i) sammenlignet med PBS-gruppen, hadde pcDNA3.1-behandling ingen signifikant effekt på IL-1β-sekresjon (ANOVA, F(4,29)=4,062, P=0,9998), men, IL-β-sekresjon var signifikant forhøyet i G. duodenalis-cystegruppen (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alfa-2-giardin og pcDNA3.1- Intramuskulær injeksjon av alfa-7.3-giardin økte serum-IL-1β-nivåene signifikant (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3-giardin induserte høye nivåer av IL-1β-sekresjon i den intramuskulære injeksjonsgruppen for pcDNA3.1-alfa-2-giardin (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Sammenlignet med hver gruppe i MCC950-behandlingsgruppen og MOCK-gruppen: (i) IL-1β-sekresjonsnivåer i PBS-kontrollgruppen og pcDNA3.1-kontrollgruppen sank til en viss grad etter blokkering av MCC950-hemmeren, men forskjellen var ikke signifikant (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) etter blokkering av MCC950., ble IL-1β-sekresjonen signifikant redusert i gruppen G. duodenalis cysteinfiserte, pcDNA3.1-alfa-2 giardingruppen og pcDNA3.1-alfa-7.3 giardingruppen (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120; ) = 3,540, P = 0,0164).Disse resultatene tyder på at alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin medierer aktiveringen av NLRP3-inflammasomet in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardiner aktiverer NLRP3-vertsinflammasomet in vivo.Mus ble immunisert (IM) med rekombinant eukaryotisk ekspresjonsplasmid pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin og deretter behandlet med MCC950 (ip; MCC950-gruppe) eller ikke (dummy-gruppe) ).PBS- eller pcDNA3.1(+)-plasmidbehandlingsgruppen ble brukt som negativ kontroll, G. duodenalis cystebehandlingsgruppen ble brukt som positiv kontroll.Eksperimentell gruppe og behandlingsregime.b Serumnivåer av IL-1β i mus ble målt på dag 7 ved ELISA-analyse.Forskjeller mellom gruppene i MOCK-gruppen ble analysert ved å bruke enveis ANOVA, og forskjellene mellom MOCK-gruppen og MCC950-gruppen ble analysert ved å bruke t-testen til SPSS programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom behandlingsgruppene i MOCK-gruppen, *P<0,05 og ***P<0,001;dollartegn ($) indikerer signifikante forskjeller mellom hver gruppe i MOCK-gruppen og MCC950-gruppen ved P<0,05.Resultater av syv uavhengige biologiske eksperimenter.i, intramuskulær injeksjon, ns, ikke signifikant (P > 0,05)
For å undersøke effekten av alfa-2- og alfa-7.3-giardin-mediert aktivering av NLRP3-vertsinflammasomet på G. duodenalis-infektivitet, brukte vi WT C57BL/6-mus og injiserte alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin.plasmidet ble injisert intramuskulært etter 3 dager gjennom magesonden til G. duodenalis-cysten, hvoretter musene ble observert i 7 dager.Et detaljert skjema for eksperimentet er vist i fig. 5a.Kroppsvekten til hver mus ble målt hver dag, prøver av friskt duodenalt vev ble samlet på den 7. dagen etter administrering gjennom en magesonde, antall trofozoitter ble målt og histopatologiske endringer ble observert.Som vist i figur 5b, med økende matetid, økte BW til mus i hver gruppe gradvis.MT for mus begynte å avta på den tredje dagen etter intragastrisk administrering av G. duodenalis-cyster, og økte deretter gradvis.Aktivering av NLRP3-inflammasomet indusert ved intramuskulær injeksjon av alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin svekket vekttapet betydelig hos mus (Dag 1: pcDNA3.1-alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 Dag 1: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Dag 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardin, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 Dag 3: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 Dag 4: pcDNA3,1-alfa-2 giard , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, dag 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, dag 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 5: pcDNA3,1-alfa -7,3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 Dag 6: pcDNA3. alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, dag 6: pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;Dag 7: pcDNA3.1-alfa-2-giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 Dag 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardin, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Den parasittiske belastningen ble vurdert i tolvfingertarmen (fig. 5c).Sammenlignet med den ubehandlede positive kontrollen og gruppen injisert med den tomme pcDNA3.1-vektoren, ble antallet G. duodenalis trofozoitter betydelig redusert i gruppene injisert med α-2-giardin og α-7,3-giardin (pcDNA3.1-alfa) -2 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3,1-alfa-7,3 giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).I tillegg var giardine alfa-7,3 mer beskyttende hos mus enn giardine alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).Resultatene av HE-farging er vist i fig.5d–f.Mus injisert med alfa-2 giardine og alfa-7.3 giardine hadde færre duodenale vevslesjoner, manifestert ved villusskade, sammenlignet med mus injisert med G. duodenalis og mus injisert med G. duodenalis i kombinasjon med en tom pcDNA3 vektor .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 eller P = 0.0068; pcDNA3.1-alfa-7.3-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0,0028 eller P = 0,0055) og redusert kryptatrofi (pcDNA3.1-alfa-2-giardin: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 eller P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardin: ANOVA , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 eller P = 0,0191).Disse resultatene tyder på at alfa-2-giardin og alfa-7,3-giardin reduserer infeksjonsevnen til G. duodenalis ved å aktivere NLRP3-inflammasomet in vivo.
Rollen til pcDNA3.1(+)-giardiner i G. duodenalis-infeksjon.Mus ble immunisert (IM) med rekombinante eukaryote ekspresjonsplasmider pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardin eller pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardin og deretter utfordret med G. duodenalis-cyster (ig).PBS-gruppen og pcDNA3.1(+) + duodenal cyste-behandlingsgruppen ble brukt som negative kontrollgrupper, og duodenal cyste-behandlingsgruppen ble brukt som positiv kontrollgruppe.Eksperimentell gruppe og behandlingsregime.b MT av mus i hver av de forskjellige behandlingsgruppene ble overvåket i 7 dager etter utfordring.Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom grupper i G. duodenalis-gruppen og pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardingruppen, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001;dollartegnet ($) indikerer en signifikant forskjell mellom hver gruppe av G. duodenalis og pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardingruppen, $$P<0.01 og $$$P<0.001.c Parasittisk belastning ble bestemt ved å telle antall trofozoitter i 1 ml tolvfingertarmskylling fra tolvfingertarmen (3 cm lang) og uttrykt som antall parasitter per cm tolvfingertarmen.Forskjeller mellom G. duodenalis-infeksjonsgruppen, pcDNA3.1(+)-alfa-2-giardingruppen og pcDNA3.1(+)-alfa-7.3-giardingruppen ble analysert ved enveis ANOVA ved bruk av SPSS-programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller ved **P<0,01 og ***P<0,001.d Histopatologiske endringer i tolvfingertarmen.Røde piler indikerer skade på villi, grønne piler indikerer skade på kryptene.Målestokk: 100 µm.e, f Statistisk analyse av mus duodenal villus høyde (e) og krypt høyde (f).Forskjeller mellom grupper i figur 1d ble analysert ved enveis ANOVA ved bruk av SPSS-programvareversjon 22.0.Stjerner indikerer signifikante forskjeller ved *P<0,05 og **P<0,01.Resultater av syv uavhengige biologiske eksperimenter.ns, ikke signifikant (P > 0,05)
Giardia duodenum er en velkjent tarmparasitt hos mennesker og andre pattedyr som forårsaker giardiasis.I 2004 ble det inkludert i WHOs initiativ for neglected Diseases på grunn av dens høye prevalens over 6 år, spesielt i samfunn med lav sosioøkonomisk status [32].Det medfødte immunsystemet spiller en kritisk rolle i immunresponsen mot G. duodenalis-infeksjon.Musemakrofager er rapportert å oppsluke og drepe G. duodenalis ved å frigjøre ekstracellulære feller [33].Våre tidligere studier har vist at G. duodenalis, en ikke-invasiv ekstracellulær parasitt, aktiverer p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 og NLRP3 inflammatoriske signalveier i musemakrofager for å regulere vertens inflammatoriske responser, og frigjort GEV kan forsterke denne prosessen.13], 24].Imidlertid gjenstår de nøyaktige PAMP-ene involvert i NLRP3-inflammasomregulert betennelse i GEV og rollen til NLRP3-inflammasom i giardiasis å bli belyst.For å belyse disse to spørsmålene, gjennomførte vi denne studien.
NLRP3-inflammasomet er lokalisert i cytoplasmaet til immunceller og kan aktiveres av ulike partikler som urinsyrekrystaller, toksiner, bakterier, virus og parasitter.I bakterielle studier har toksiner blitt identifisert som nøkkel PAMPs som aktiverer inflammatoriske sensorer, noe som fører til betennelse og celledød [34].Noen strukturelt forskjellige toksiner, som hemolysin fra Staphylococcus aureus [35] og Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) fra enterotoksin (NHE) [37], induserer aktiveringen av NLRP3-betennelse.Virale studier har vist at virulensproteiner som SARS-COV-2 envelope (E) protein [38] og Zika virus NS5 protein [39] er viktige PAMPs gjenkjent av NLRP3 reseptoren.I parasittstudier har mange parasitter blitt rapportert å være assosiert med vertsinflammasomaktivering, slik som Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] og Leishmania [42].De tette granulatproteinene GRA35, GRA42 og GRA43, assosiert med virulensen til Toxoplasma gondii, er nødvendig for induksjon av pyroptose i Lewis-rottemakrofager [43].I tillegg har noen Leishmania-studier fokusert på individuelle molekyler involvert i NLRP3-inflammasomet, slik som parasittmembranlipofosfoglykan [44] eller sinkmetalloprotease [45].Blant den anneksinlignende alfa-giardin-familien av gener har alfa-1-giardin vist seg å være en potensiell vaksinekandidat som gir beskyttelse mot G. duodenalis i en musemodell [18].I vår studie valgte vi G. duodenalis virulensfaktorer alfa-2 og alfa-7,3 giardiner, som er unike for giardia, men relativt mindre rapportert.Disse to målgenene ble klonet inn i pcDNA3.1(+) eukaryot ekspresjonssystemvektoren for analyse av betennelsesaktivering.
I vår musemodell fungerer spaltede caspasefragmenter som markører for inflammatorisk aktivering.Ved stimulering interagerer NLRP3 med ASC, rekrutterer procaspaser og genererer aktive caspaser som spalter pro-IL-1β og pro-IL-18 til moden IL-1β og IL-18, henholdsvis -18.Inflammatoriske kaspaser (kaspaser-1, -4, -5 og -11) er en bevart familie av cysteinproteaser som er kritiske for medfødt forsvar og er involvert i betennelse og programmert celledød [46].Caspase-1 aktiveres av kanoniske inflammasomer [47], mens kaspaser-4, -5 og -11 spaltes under dannelsen av atypiske inflammasomer [48].I denne studien brukte vi muse peritoneale makrofager som modell og undersøkte p20 caspase-1 spaltet caspase-1 som en markør for vertens NLRP3 inflammasjonsaktivering i studier av G. duodenalis infeksjon.Resultatene viste at mange alfa-giardiner er ansvarlige for den typiske aktiveringen av betennelse, som er i samsvar med oppdagelsen av viktige virulensmolekyler involvert i bakterier og virus.Vår studie er imidlertid kun en foreløpig screening og det er andre molekyler som kan aktivere ikke-klassiske inflammasomer, ettersom vår forrige studie fant både klassiske og ikke-klassiske inflammasomer ved G. duodenalis-infeksjon [13].For ytterligere å bestemme om den genererte p20-kaspase-1 er assosiert med NLRP3-inflammasomet, transfekterte vi alfa-2- og alfa-7.3-giardiner til peritoneale musemakrofager for å bestemme nøkkelmolekylproteinekspresjonsnivåer og ASC-oligomeriseringsnivåer, noe som bekrefter at begge α-giardinene aktiveres inflammasom NLRP3.Resultatene våre er litt forskjellige fra resultatene til Manko-Prykhoda et al., som rapporterte at stimulering av Caco-2-celler med G. muris eller E. coli EPEC-stammer alene kan øke fluorescensintensiteten til NLRP3, ASC og caspase-1, men ikke signifikant, mens hvordan samstimulering av G. muris og E. coli økte nivåene av tre proteiner [49].Dette avviket kan skyldes forskjeller i utvalget av Giardia-arter, cellelinjer og primære celler.Vi utførte også in vivo-analyser ved bruk av MCC950 i 5 uker gamle WT C57BL/6 hunnmus, som er mer utsatt for G. duodenalis.MCC950 er en potent og selektiv liten molekyl NLRP3-hemmer som blokkerer kanonisk og ikke-kanonisk NLRP3-aktivering ved nanomolare konsentrasjoner.MCC950 hemmer NLRP3-aktivering, men påvirker ikke aktiveringen av AIM2-, NLRC4- og NLRP1-inflammatoriske veier eller TLR-signalveier [27].MCC950 blokkerer NLRP3-aktivering, men hemmer ikke NLRP3-initiering, K+-utstrømning, Ca2+-tilstrømning eller interaksjonen mellom NLRP3 og ASC;i stedet hemmer det NLRP3-inflammasomaktivering ved å blokkere ASC-oligomerisering [27].Derfor brukte vi MCC950 i en in vivo-studie for å bestemme rollen til NLRP3-inflammasomet etter giardin-injeksjon.Aktivert caspase-1 p10 spalter pro-inflammatoriske cytokiner pro-IL-1β og pro-IL-18 til moden IL-1β og IL-18 [50].I denne studien ble serum-IL-1β-nivåer i giardinbehandlede mus med eller uten MCC950 brukt som en indikator på om NLRP3-inflammasomet var aktivert.Som forventet reduserte MCC950-behandling signifikant serum IL-1β-nivåer.Disse dataene viser tydelig at G. duodenalis giardin alfa-2 og giardin alfa-7.3 er i stand til å aktivere NLRP3-museinflammasomet.
Betydelige data akkumulert i løpet av det siste tiåret har vist at IL-17A er hovedregulatoren av immunitet mot G. muris, induserer IL-17RA-signalering, produserer antimikrobielle peptider og regulerer komplementaktivering [51].Giardia-infeksjon forekommer imidlertid hyppigere hos unge voksne, og det har blitt rapportert at Giardia-infeksjon hos unge mus ikke aktiverer IL-17A-responsen for å utøve sin beskyttende effekt [52], noe som får forskere til å se etter andre immunmodulerende Giardia.mekanismer for helminth-infeksjon.Forfatterne av en fersk studie rapporterte at G. muris kan aktivere NLRP3-inflammasomet av E. coli EPEC, som fremmer produksjonen av antimikrobielle peptider og reduserer dets bindingskapasitet og antall trofozoitter i tarmkanalen, og dermed redusere alvorlighetsgraden av tykktarmen. sykdommer forårsaket av basiller [49].NLRP3-inflammasomet er involvert i utviklingen av ulike sykdommer.Studier har vist at Pseudomonas aeruginosa utløser autofagi i makrofager for å unngå celledød, og denne prosessen avhenger av aktiveringen av NLRP3-inflammasomet [53].For N. caninum begrenser reaktiv oksygenarter-mediert aktivering av NLRP3-inflammasomet replikasjonen i verten, noe som gjør den til et potensielt terapeutisk mål [9].Paracoccidioides brasiliensis har vist seg å indusere aktivering av NLRP3-inflammasomet i musebenmargsavledede dendritiske celler, noe som resulterer i frigjøring av det inflammatoriske cytokinet IL-1β, som spiller en kritisk rolle i vertsforsvaret [10].Flere Leishmania-arter, inkludert L. amazonensis, L. major, L. braziliensis og L. infantum chagasi, aktiverer NLRP3 og ASC-avhengig caspase-1 i makrofager, samt Leishmania-infeksjon.Parasittreplikasjon er forbedret hos mus som mangler NLRP3/ASC/caspase-1-genet [11].Zamboni et al.Leishmania-infeksjon har blitt rapportert å indusere aktivering av NLRP3-inflammasomet i makrofager, noe som begrenser intracellulær parasittreplikasjon.Dermed kan Leishmania hemme NLRP3-aktivering som en unngåelsesstrategi.I in vivo-studier bidro NLRP3-inflammasomet til eliminering av Leishmania, men påvirket ikke vev [54].Omvendt, i helminthiasisstudier, undertrykte aktivering av NLRP3-inflammasomet vertens beskyttende immunitet mot gastrointestinal helminthiasis [12].Shigella er en av de viktigste bakteriene som forårsaker diaré over hele verden.Disse bakteriene kan indusere IL-1β-produksjon gjennom P2X7-reseptormediert K+-utstrømning, reaktive oksygenarter, lysosomal forsuring og mitokondriell skade.NLRP3-inflammasomet regulerer negativt fagocytose og bakteriedrepende aktivitet av makrofager mot Shigella [55].Plasmodium-studier har vist at mus med AIM2, NLRP3 eller caspase-1-mangel infisert med Plasmodium produserer høye nivåer av type 1 interferon og er mer motstandsdyktige mot Plasmodium-infeksjon [56].Imidlertid er rollen til alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin i å indusere patogen aktivering av NLRP3-betennelse hos mus uklar.
I denne studien reduserte inhibering av NLRP3-inflammasomet av MCC950 BW og økte antall trofozoitter i tarmskyllevæske hos mus, noe som resulterte i mer alvorlige patologiske endringer i duodenalt vev.Alfa-2-giardin og alfa-7.3-giardin aktiverer vertsmus NLRP3-inflammasomet, øker musens kroppsvekt, reduserer antall trofozoitter i tarmskyllevæske og lindrer patologiske duodenale lesjoner.Disse resultatene tyder på at G. duodenalis kan aktivere NLRP3-vertsinflammasomet via alfa-2-giardin og alfa-7,3-giardin, noe som reduserer patogenisiteten til G. duodenalis hos mus.
Samlet viser resultatene våre at alfa-2 og alfa-7.3 giardiner induserer aktiveringen av NLRP3 vertsinflammasomet og reduserer smitteevnen til G. duodenalis hos mus.Derfor er disse molekylene lovende mål for forebygging av giardiasis.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: en oversikt.Det ble nylig avslørt at Pat Inflamm er allergisk mot narkotika.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: en gjennomgang av farmakoterapi.Ekspertuttalelse fra en farmasøyt.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, medikamentresistens og oppdagelsen av nye mål.Infiserer Disord-medisinmål.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, etc. NLRP3 inflammasom- og inflammatoriske sykdommer.Oxide Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Rollen til inflammasomet i tarmbetennelse og kreft.Gastroenterologi.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanonisk og atypisk NLRP3-inflammasomaktivering i krysset mellom immuntoleranse og tarmbetennelse.pre-immun.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.ROS-mediert NLRP3-inflammasomaktivering er involvert som respons på N. caninum-infeksjon.Parasitt vektor.2020;13:449.