Takk for at du besøker Nature.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Genvektorer for behandling av pulmonal cystisk fibrose må målrettes mot de ledende luftveiene, siden perifer lungetransduksjon ikke har noen terapeutisk effekt.Effektiviteten av viral transduksjon er direkte relatert til oppholdstiden til bæreren.Imidlertid diffunderer leveringsvæsker som genbærere naturlig inn i alveolene under inhalering, og terapeutiske partikler av enhver form fjernes raskt ved slimhinnetransport.Å forlenge oppholdstiden for genbærere i luftveiene er viktig, men vanskelig å få til.Bærerkonjugerte magnetiske partikler som kan rettes til overflaten av luftveiene kan forbedre regional målretting.På grunn av problemer med in vivo-avbildning, er oppførselen til slike små magnetiske partikler på luftveisoverflaten i nærvær av et påført magnetfelt dårlig forstått.Målet med denne studien var å bruke synkrotronavbildning for å visualisere in vivo bevegelsen av en serie magnetiske partikler i luftrøret til bedøvede rotter for å studere dynamikken og oppførselsmønstrene til enkelt- og bulkpartikler in vivo.Vi vurderte også om levering av lentivirale magnetiske partikler i nærvær av et magnetfelt ville øke effektiviteten av transduksjon i rotteluftrøret.Synkrotron røntgenavbildning viser oppførselen til magnetiske partikler i stasjonære og bevegelige magnetiske felt in vitro og in vivo.Partikler kan ikke lett dras over overflaten av levende luftveier ved hjelp av magneter, men under transport konsentreres avsetninger i synsfeltet, der magnetfeltet er sterkest.Transduksjonseffektiviteten ble også økt seks ganger når lentivirale magnetiske partikler ble levert i nærvær av et magnetfelt.Til sammen antyder disse resultatene at lentivirale magnetiske partikler og magnetiske felt kan være verdifulle tilnærminger for å forbedre genvektormålretting og transduksjonsnivåer i de ledende luftveiene in vivo.
Cystisk fibrose (CF) er forårsaket av variasjoner i et enkelt gen kalt CF transmembrane conductance regulator (CFTR).CFTR-proteinet er en ionekanal som er tilstede i mange epitelceller i hele kroppen, inkludert luftveiene, et hovedsted i patogenesen av cystisk fibrose.Defekter i CFTR fører til unormal vanntransport, dehydrering av luftveisoverflaten og redusert luftveisoverflatefluidlag (ASL) dybde.Det svekker også evnen til mucociliary transport (MCT)-systemet til å rense luftveiene for inhalerte partikler og patogener.Målet vårt er å utvikle en lentiviral (LV) genterapi for å levere den korrekte kopien av CFTR-genet og forbedre ASL, MCT og lungehelse, og å fortsette å utvikle nye teknologier som kan måle disse parameterne in vivo1.
LV-vektorer er en av de ledende kandidatene for cystisk fibrose-genterapi, hovedsakelig fordi de permanent kan integrere det terapeutiske genet i luftveisbasalceller (luftveisstamceller).Dette er viktig fordi de kan gjenopprette normal hydrering og slimclearance ved å differensiere til funksjonelle genkorrigerte luftveisoverflateceller assosiert med cystisk fibrose, noe som resulterer i livslange fordeler.LV-vektorer må rettes mot de ledende luftveiene, da det er her lungenes involvering i CF begynner.Levering av vektoren dypere inn i lungen kan resultere i alveolar transduksjon, men dette har ingen terapeutisk effekt ved cystisk fibrose.Imidlertid migrerer væsker som genbærere naturlig inn i alveolene når de inhaleres etter fødsel3,4 og terapeutiske partikler blir raskt utstøtt inn i munnhulen av MCT.Effektiviteten til LV-transduksjon er direkte relatert til hvor lang tid vektoren forblir nær målcellene for å tillate cellulært opptak - "oppholdstid" 5 som lett forkortes av typisk regional luftstrøm samt koordinert opptak av slim og MCT-partikler.For cystisk fibrose er evnen til å forlenge LV-oppholdstid i luftveiene viktig for å oppnå høye nivåer av transduksjon i dette området, men har så langt vært utfordrende.
For å overvinne denne hindringen foreslår vi at LV magnetiske partikler (MPs) kan hjelpe på to komplementære måter.For det første kan de styres av en magnet til luftveisoverflaten for å forbedre målrettingen og hjelpe genbærerpartikler til å være i riktig område av luftveien;og ASL) beveger seg inn i cellelag 6. MPer er mye brukt som målrettet medikamentleveringsvehikler når de binder seg til antistoffer, kjemoterapimedisiner eller andre små molekyler som fester seg til cellemembraner eller binder seg til deres respektive celleoverflatereseptorer og akkumuleres på tumorsteder i tilstedeværelse av statisk elektrisitet.Magnetiske felt for kreftbehandling 7. Andre "hypertermiske" metoder er rettet mot å drepe tumorceller ved å varme opp MPer når de utsettes for oscillerende magnetiske felt.Prinsippet for magnetisk transfeksjon, der et magnetfelt brukes som et transfeksjonsmiddel for å forbedre overføringen av DNA til celler, brukes ofte in vitro ved å bruke en rekke ikke-virale og virale genvektorer for vanskelige å transdusere cellelinjer ..Effektiviteten av LV-magnetotransfeksjon med levering av LV MP in vitro inn i en cellelinje av humant bronkialepitel i nærvær av et statisk magnetfelt ble etablert, og økte transduksjonseffektiviteten med 186 ganger sammenlignet med LV-vektoren alene.LV MT har også blitt brukt på en in vitro-modell av cystisk fibrose, der magnetisk transfeksjon økte LV-transduksjon i luft-væske-grensesnittkulturer med en faktor på 20 i nærvær av cystisk fibrose-sputum10.Imidlertid har in vivo organmagnetotransfeksjon fått relativt lite oppmerksomhet og har bare blitt evaluert i noen få dyrestudier11,12,13,14,15, spesielt i lungene16,17.Mulighetene for magnetisk transfeksjon i lungeterapi ved cystisk fibrose er imidlertid klare.Tan et al.(2020) uttalte at "en valideringsstudie på effektiv pulmonal levering av magnetiske nanopartikler vil bane vei for fremtidige CFTR-inhalasjonsstrategier for å forbedre kliniske resultater hos pasienter med cystisk fibrose"6.
Oppførselen til små magnetiske partikler på overflaten av luftveiene i nærvær av et påført magnetfelt er vanskelig å visualisere og studere, og derfor er de dårlig forstått.I andre studier har vi utviklet en Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) metode for ikke-invasiv avbildning og kvantifisering av små in vivo endringer i ASL18 dybde og MCT19 oppførsel,20 for direkte å måle gasskanal overflatehydrering og brukes som en tidlig indikator for behandlingseffektivitet.I tillegg bruker vår MCT-scoringsmetode partikler med en diameter på 10–35 µm bestående av aluminiumoksyd eller glass med høy brytningsindeks som MCT-markører synlige med PB-PCXI21.Begge metodene er egnet for avbildning av en rekke partikkeltyper, inkludert MP-er.
På grunn av den høye romlige og tidsmessige oppløsningen er våre PB-PCXI-baserte ASL- og MCT-analyser godt egnet til å studere dynamikken og atferdsmønstrene til enkelt- og bulkpartikler in vivo for å hjelpe oss med å forstå og optimalisere MP-genleveringsmetoder.Tilnærmingen vi bruker her er basert på våre studier ved bruk av SPring-8 BL20B2 beamline, der vi visualiserte væskebevegelse etter levering av en dose av en dummy-vektor inn i nese- og lungeluftveiene til mus for å forklare våre heterogene genekspresjonsmønstre observert i genet vårt.dyrestudier med en bærerdose på 3,4.
Målet med denne studien var å bruke PB-PCXI-synkrotronen til å visualisere in vivo-bevegelser av en serie MP-er i luftrøret til levende rotter.Disse PB-PCXI-bildestudiene ble designet for å teste MP-serien, magnetfeltstyrke og plassering for å bestemme deres effekt på MP-bevegelse.Vi antok at et eksternt magnetfelt ville hjelpe den leverte MF med å holde seg eller flytte til målområdet.Disse studiene tillot oss også å bestemme magnetkonfigurasjoner som maksimerer mengden partikler igjen i luftrøret etter avsetning.I en andre serie studier tok vi sikte på å bruke denne optimale konfigurasjonen for å demonstrere transduksjonsmønsteret som følge av in vivo-levering av LV-MP-er til rotteluftveiene, under antagelsen om at levering av LV-MP-er i sammenheng med luftveismålretting ville resultere i økt LV-transduksjonseffektivitet..
Alle dyrestudier ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of Adelaide (M-2019-060 og M-2020-022) og SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Forsøkene ble utført i henhold til anbefalingene til ARRIVE.
Alle røntgenbilder ble tatt ved BL20XU-strålelinjen ved SPring-8-synkrotronen i Japan ved å bruke et oppsett som ligner på det som er beskrevet tidligere21,22.Kort fortalt var den eksperimentelle boksen plassert 245 m fra synkrotronlagringsringen.En prøve-til-detektor-avstand på 0,6 m brukes for partikkelavbildningsstudier og 0,3 m for in vivo-avbildningsstudier for å skape fasekontrasteffekter.En monokromatisk stråle med en energi på 25 keV ble brukt.Bildene ble tatt med en høyoppløselig røntgentransduser (SPring-8 BM3) koblet til en sCMOS-detektor.Transduseren konverterer røntgenstråler til synlig lys ved hjelp av en 10 µm tykk scintillator (Gd3Al2Ga3O12), som deretter rettes til sCMOS-sensoren ved hjelp av et ×10 (NA 0,3) mikroskopobjektiv.sCMOS-detektoren var en Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) med en matrisestørrelse på 2048 × 2048 piksler og en rå pikselstørrelse på 6,5 × 6,5 µm.Denne innstillingen gir en effektiv isotropisk pikselstørrelse på 0,51 µm og et synsfelt på omtrent 1,1 mm × 1,1 mm.Eksponeringsvarigheten på 100 ms ble valgt for å maksimere signal-til-støy-forholdet til magnetiske partikler i og utenfor luftveiene, samtidig som bevegelsesartefakter forårsaket av pust ble minimalisert.For in vivo-studier ble en rask røntgenlukker plassert i røntgenbanen for å begrense strålingsdosen ved å blokkere røntgenstrålen mellom eksponeringene.
LV-medier ble ikke brukt i noen SPring-8 PB-PCXI-bildestudier fordi BL20XU-bildekammeret ikke er biosikkerhetsnivå 2-sertifisert.I stedet valgte vi en rekke velkarakteriserte parlamentsmedlemmer fra to kommersielle leverandører som dekker en rekke størrelser, materialer, jernkonsentrasjoner og bruksområder – først for å forstå hvordan magnetiske felt påvirker bevegelsen til parlamentsmedlemmer i glasskapillærer, og deretter i levende luftveier.flate.Størrelsen på MP varierer fra 0,25 til 18 µm og er laget av forskjellige materialer (se tabell 1), men sammensetningen av hver prøve, inkludert størrelsen på de magnetiske partiklene i MP, er ukjent.Basert på våre omfattende MCT-studier 19, 20, 21, 23, 24, forventer vi at MP-er ned til 5 µm kan sees på luftrørets overflate, for eksempel ved å trekke fra påfølgende rammer for å se forbedret synlighet av MP-bevegelse.En enkelt MP på 0,25 µm er mindre enn oppløsningen til bildebehandlingsenheten, men PB-PCXI forventes å oppdage deres volumetriske kontrast og bevegelsen til overflatevæsken som de er avsatt på etter å ha blitt avsatt.
Prøver for hver MP i tabellen.1 ble fremstilt i 20 μl glasskapillærer (Drummond Microcaps, PA, USA) med en indre diameter på 0,63 mm.Korpuskulære partikler er tilgjengelige i vann, mens CombiMag-partikler er tilgjengelige i produsentens proprietære væske.Hvert rør er halvt fylt med væske (ca. 11 µl) og plassert på prøveholderen (se figur 1).Glasskapillærene ble plassert henholdsvis horisontalt på scenen i avbildningskammeret og plassert ved kantene av væsken.En 19 mm diameter (28 mm lang) nikkelskallmagnet laget av sjeldne jordarter, neodym, jern og bor (NdFeB) (N35, kat.nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) med en remanens på 1,17 T ble festet til en separat overføringstabell for å oppnå Fjernt endre posisjonen din under gjengivelsen.Røntgenbildebehandling begynner når magneten er plassert omtrent 30 mm over prøven og bilder tas med 4 bilder per sekund.Under avbildning ble magneten brakt nær glasskapillærrøret (i en avstand på ca. 1 mm) og deretter flyttet langs røret for å vurdere effekten av feltstyrke og posisjon.
Et in vitro-bildeoppsett som inneholder MP-prøver i glasskapillærer på translasjonsstadiet av xy-prøven.Banen til røntgenstrålen er markert med en rød stiplet linje.
Så snart in vitro-synligheten til parlamentsmedlemmer ble etablert, ble en undergruppe av dem testet in vivo på villtype Wistar-albinorotter (~12 uker gamle, ~200 g).Medetomidin 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japan), midazolam 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) og butorfanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Rotter ble bedøvet med Pharma (Japan) blanding ved intraperitoneal injeksjon.Etter anestesi ble de klargjort for avbildning ved å fjerne pelsen rundt luftrøret, sette inn en endotrakeal tube (ET; 16 Ga intravenøs kanyle, Terumo BCT), og immobilisere dem i ryggleie på en spesiallaget bildeplate som inneholder en termisk pose for å opprettholde kroppstemperaturen.22. Bildeplaten ble deretter festet til prøvetrinnet i bildeboksen i en liten vinkel for å justere luftrøret horisontalt på røntgenbildet som vist i figur 2a.
(a) In vivo-bildeoppsett i SPring-8-bildeenheten, røntgenstrålebane merket med rød stiplet linje.(b,c) Trakeal magnetlokalisering ble utført eksternt ved bruk av to ortogonalt monterte IP-kameraer.På venstre side av bildet på skjermen kan du se trådløkken som holder hodet og leveringskanylen installert inne i ET-røret.
Et fjernstyrt sprøytepumpesystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) ved bruk av en 100 µl glasssprøyte ble koblet til en PE10-slange (0,61 mm OD, 0,28 mm ID) ved bruk av en 30 Ga nål.Merk røret for å sikre at spissen er i riktig posisjon i luftrøret når endotrakealtuben settes inn.Ved hjelp av en mikropumpe ble sprøytestempelet fjernet og tuppen av røret ble nedsenket i MP-prøven som skulle leveres.Det ladede leveringsrøret ble deretter satt inn i endotrakealrøret, og plasserte spissen på den sterkeste delen av vårt forventede påførte magnetiske felt.Bildeopptak ble kontrollert ved hjelp av en pustedetektor koblet til vår Arduino-baserte timingboks, og alle signaler (f.eks. temperatur, respirasjon, lukkeråpning/lukking og bildeopptak) ble tatt opp med Powerlab og LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Ved bildebehandling Når huset var utilgjengelig, ble to IP-kameraer (Panasonic BB-SC382) plassert i omtrent 90° i forhold til hverandre og brukt til å kontrollere posisjonen til magneten i forhold til luftrøret under avbildning (Figur 2b, c).For å minimere bevegelsesartefakter ble det tatt ett bilde per pust under det terminale respiratoriske strømningsplatået.
Magneten er festet til det andre trinnet, som kan være plassert eksternt på utsiden av avbildningslegemet.Ulike posisjoner og konfigurasjoner av magneten ble testet, inkludert: plassert i en vinkel på omtrent 30° over luftrøret (konfigurasjoner er vist i figur 2a og 3a);en magnet over dyret og den andre under, med polene innstilt for tiltrekning (Figur 3b)., en magnet over dyret og en under, med polene innstilt for frastøtning (Figur 3c), og en magnet over og vinkelrett på luftrøret (Figur 3d).Etter å ha satt opp dyret og magneten og lastet MP under testing inn i sprøytepumpen, lever en dose på 50 µl med en hastighet på 4 µl/sek ved innhenting av bilder.Magneten flyttes deretter frem og tilbake langs eller på tvers av luftrøret mens den fortsetter å ta bilder.
Magnetkonfigurasjon for in vivo-avbildning (a) en magnet over luftrøret i en vinkel på omtrent 30°, (b) to magneter konfigurert for tiltrekning, (c) to magneter konfigurert for frastøting, (d) en magnet over og vinkelrett på luftrøret.Observatøren så ned fra munnen til lungene gjennom luftrøret og røntgenstrålen passerte gjennom venstre side av rotten og forlot høyre side.Magneten beveges enten langs luftveien eller til venstre og høyre over luftrøret i retning av røntgenstrålen.
Vi forsøkte også å bestemme synligheten og oppførselen til partikler i luftveiene i fravær av blanding av respirasjon og hjertefrekvens.Derfor, ved slutten av avbildningsperioden, ble dyrene humant avlivet på grunn av overdose av pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 mg/kg ip).Noen dyr ble liggende på avbildningsplattformen, og etter opphør av puste og hjerteslag, ble avbildningsprosessen gjentatt, og tilsatt en ekstra dose MP hvis ingen MP var synlig på luftveisoverflaten.
De resulterende bildene ble korrigert for flatt og mørkt felt og deretter satt sammen til en film (20 bilder per sekund; 15–25 × normal hastighet avhengig av respirasjonsfrekvens) ved å bruke et tilpasset skript skrevet i MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle studier på LV-genvektorlevering ble utført ved University of Adelaide Laboratory Animal Research Center og hadde som mål å bruke resultatene fra SPring-8-eksperimentet for å vurdere om LV-MP-levering i nærvær av et magnetfelt kunne forbedre genoverføring in vivo .For å evaluere effekten av MF og magnetfelt ble to grupper av dyr behandlet: en gruppe ble injisert med LV MF med magnetplassering, og den andre gruppen ble injisert med en kontrollgruppe med LV MF uten magnet.
LV-genvektorer har blitt generert ved bruk av tidligere beskrevne metoder 25, 26.LacZ-vektoren uttrykker et kjernefysisk lokalisert beta-galaktosidase-gen drevet av MPSV-konstitutiv promoter (LV-LacZ), som produserer et blått reaksjonsprodukt i transduserte celler, synlig på fronter og deler av lungevevet.Titrering ble utført i cellekulturer ved å manuelt telle antall LacZ-positive celler ved å bruke et hemocytometer for å beregne titeren i TU/ml.Bærere kryokonserveres ved -80°C, tines før bruk og bindes til CombiMag ved å blande 1:1 og inkubere på is i minst 30 minutter før levering.
Normale Sprague Dawley-rotter (n = 3/gruppe, ~2-3 bedøvet ip med en blanding av 0,4mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australia) og 60mg/kg ketamin (Ilium, Australia) ved 1 måneds alder) ip ) injeksjon og ikke-kirurgisk oral kanyle med en 16 Ga intravenøs kanyle.For å sikre at luftrørsvevet mottar LV-transduksjon, ble det kondisjonert ved å bruke vår tidligere beskrevne mekaniske forstyrrelsesprotokoll der luftrørets overflate ble gnidd aksialt med en trådkurv (N-sirkel, nitinolsteinekstraktor uten spiss NTSE-022115 ) -UDH , Cook Medical, USA) 30 s28.Deretter, omtrent 10 minutter etter forstyrrelsen i biosikkerhetsskapet, ble trakeal administrering av LV-MP utført.
Magnetfeltet som ble brukt i dette eksperimentet ble konfigurert på samme måte som en in vivo røntgenstudie, med de samme magnetene holdt over luftrøret med destillasjonsstentklemmer (Figur 4).Et 50 µl volum (2 x 25 µl alikvoter) av LV-MP ble levert til luftrøret (n = 3 dyr) ved bruk av en pipette med gelspiss som beskrevet tidligere.Kontrollgruppen (n = 3 dyr) fikk samme LV-MP uten bruk av magnet.Etter at infusjonen er fullført, fjernes kanylen fra endotrakealtuben og dyret ekstuberes.Magneten forblir på plass i 10 minutter før den fjernes.Rotter ble administrert subkutant med meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) etterfulgt av anestesiavbrudd ved intraperitoneal injeksjon av 1 mg/kg atipamazolhydroklorid (Antisedan, Zoetis, Australia).Rotter ble holdt varme og observert inntil fullstendig restitusjon fra anestesi.
LV-MP leveringsenhet i et biologisk sikkerhetsskap.Du kan se at den lysegrå Luer-lock-hylsen på ET-røret stikker ut av munnen, og gelpipettespissen vist på figuren føres gjennom ET-røret til ønsket dybde i luftrøret.
En uke etter LV-MP-administreringsprosedyren ble dyrene avlivet humant ved inhalering av 100 % CO2 og LacZ-ekspresjon ble vurdert ved å bruke vår standard X-gal-behandling.De tre mest kaudale bruskringene ble fjernet for å sikre at eventuell mekanisk skade eller væskeretensjon på grunn av plassering av endotrakealtube ikke ble inkludert i analysen.Hvert luftrør ble kuttet i lengderetningen for å oppnå to halvdeler for analyse og plassert i en kopp som inneholdt silikongummi (Sylgard, Dow Inc) ved å bruke en Minutien-nål (Fine Science Tools) for å visualisere den luminale overflaten.Distribusjonen og karakteren til de transduserte cellene ble bekreftet ved frontal fotografering ved bruk av et Nikon-mikroskop (SMZ1500) med et DigiLite-kamera og TCapture-programvare (Tucsen Photonics, Kina).Bildene ble tatt med 20x forstørrelse (inkludert maksimal innstilling for luftrørets fulle bredde), med hele lengden av luftrøret vist trinn for trinn, noe som ga nok overlapping mellom hvert bilde til at bilder kan "sys".Bildene fra hvert luftrør ble deretter kombinert til et enkelt sammensatt bilde ved hjelp av Composite Image Editor versjon 2.0.3 (Microsoft Research) ved bruk av planbevegelsesalgoritmen. Området med LacZ-uttrykk i trakeale sammensatte bilder fra hvert dyr ble kvantifisert ved å bruke et automatisert MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28, ved å bruke innstillinger på 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 og Value < 0,7. Området med LacZ-uttrykk i trakeal-sammensatte bilder fra hvert dyr ble kvantifisert ved å bruke et automatisert MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28, ved å bruke innstillinger på 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 og Value < 0,7. Пощад э р зииии helst татизированнges и значение <0 ,7. Området med LacZ-uttrykk i sammensatte luftrørsbilder fra hvert dyr ble kvantifisert ved hjelp av et automatisert MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet28 ved bruk av innstillinger på 0,350,15 og verdi <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复像後徺徺徺进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置.自动 自动表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определиз определиз ованного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насьщиенно, 0,15> nov. . Områder med LacZ-uttrykk på sammensatte bilder av luftrøret til hvert dyr ble kvantifisert ved hjelp av et automatisert MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) som tidligere beskrevet ved bruk av innstillinger på 0,35 < fargetone < 0,58, metning > 0,15 og verdi < 0,7.Ved å spore vevskonturer i GIMP v2.10.24 ble det laget en maske manuelt for hvert komposittbilde for å identifisere vevsområdet og forhindre eventuelle falske deteksjoner utenfor luftrørsvevet.De fargede områdene fra alle sammensatte bilder fra hvert dyr ble summert for å gi det totale fargede området for det dyret.Det malte området ble deretter delt på det totale arealet av masken for å oppnå et normalisert område.
Hvert luftrør ble innebygd i parafin og snittet 5 µm tykt.Snitt ble motfarget med nøytral hurtigrød i 5 minutter og bilder ble tatt med et Nikon Eclipse E400-mikroskop, DS-Fi3-kamera og NIS-elementfangstprogramvare (versjon 5.20.00).
Alle statistiske analyser ble utført i GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistisk signifikans ble satt til p ≤ 0,05.Normalitet ble testet ved bruk av Shapiro-Wilk-testen og forskjeller i LacZ-farging ble vurdert ved bruk av en uparet t-test.
De seks MP-ene beskrevet i Tabell 1 ble undersøkt med PCXI, og synligheten er beskrevet i Tabell 2. To polystyren MP-er (MP1 og MP2; henholdsvis 18 µm og 0,25 µm) var ikke synlige av PCXI, men de resterende prøvene kunne identifiseres (eksempler er vist i figur 5).MP3 og MP4 er svakt synlige (10-15 % Fe3O4; henholdsvis 0,25 µm og 0,9 µm).Selv om MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 µm) inneholdt noen av de minste partiklene som ble testet, var det den mest uttalte.CombiMag MP6-produktet er vanskelig å skille.I alle tilfeller ble vår evne til å oppdage MF-er kraftig forbedret ved å flytte magneten frem og tilbake parallelt med kapillæren.Etter hvert som magnetene beveget seg bort fra kapillæren, ble partiklene trukket ut i lange kjeder, men etter hvert som magnetene nærmet seg og magnetfeltstyrken økte, ble partikkelkjedene forkortet ettersom partiklene migrerte mot den øvre overflaten av kapillæren (se tilleggsvideo S1 : MP4), øker partikkeltettheten ved overflaten.Motsatt, når magneten fjernes fra kapillæren, synker feltstyrken og MP-ene omorganiseres til lange kjeder som strekker seg fra den øvre overflaten av kapillæren (se tilleggsvideo S2: MP4).Etter at magneten slutter å bevege seg, fortsetter partiklene å bevege seg en stund etter at de har nådd likevektsposisjonen.Når MP beveger seg mot og bort fra den øvre overflaten av kapillæren, har de magnetiske partiklene en tendens til å trekke rusk gjennom væsken.
Synligheten til MP under PCXI varierer betydelig mellom prøvene.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Alle bildene som vises her ble tatt med en magnet plassert omtrent 10 mm rett over kapillæren.De tilsynelatende store sirklene er luftbobler fanget i kapillærene, og viser tydelig de svarte og hvite kanttrekkene til fasekontrastbildet.Den røde boksen indikerer forstørrelsen som øker kontrasten.Merk at diameteren til magnetkretsene i alle figurene ikke er i skala og er omtrent 100 ganger større enn vist.
Når magneten beveger seg til venstre og høyre langs toppen av kapillæren, endres vinkelen til MP-strengen slik at den er på linje med magneten (se figur 6), og avgrenser dermed de magnetiske feltlinjene.For MP3-5, etter at akkorden når terskelvinkelen, drar partiklene langs den øvre overflaten av kapillæren.Dette resulterer ofte i at MP-er grupperer seg i større grupper nær der magnetfeltet er sterkest (se tilleggsvideo S3: MP5).Dette er også spesielt tydelig ved avbildning nær enden av kapillæren, noe som får MP til å aggregere og konsentrere seg ved væske-luft-grensesnittet.Partiklene i MP6, som var vanskeligere å skille enn de i MP3-5, trakk seg ikke når magneten beveget seg langs kapillæren, men MP-strengene dissosierte seg og lot partiklene være synlige (se tilleggsvideo S4: MP6).I noen tilfeller, når det påførte magnetiske feltet ble redusert ved å flytte magneten en lang avstand fra bildestedet, sank eventuelle gjenværende MP-er sakte ned til bunnen av røret ved hjelp av tyngdekraften, og ble igjen i strengen (se tilleggsvideo S5: MP3) .
Vinkelen på MP-strengen endres når magneten beveger seg til høyre over kapillæren.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 og (d) MP6.Den røde boksen indikerer forstørrelsen som øker kontrasten.Vær oppmerksom på at tilleggsvideoene er til informasjonsformål da de avslører viktig partikkelstruktur og dynamisk informasjon som ikke kan visualiseres i disse statiske bildene.
Våre tester har vist at flytting av magneten sakte frem og tilbake langs luftrøret letter visualiseringen av MF i sammenheng med kompleks bevegelse in vivo.Ingen in vivo tester ble utført fordi polystyrenkulene (MP1 og MP2) ikke var synlige i kapillæren.Hver av de resterende fire MF-ene ble testet in vivo med den lange aksen til magneten plassert over luftrøret i en vinkel på omtrent 30° i forhold til vertikalen (se figur 2b og 3a), da dette resulterte i lengre MF-kjeder og var mer effektiv enn en magnet..konfigurasjonen avsluttet.MP3, MP4 og MP6 er ikke funnet i luftrøret til noen levende dyr.Ved visualisering av luftveiene til rotter etter humant avliving av dyrene, forble partiklene usynlige selv når ytterligere volum ble tilsatt ved hjelp av en sprøytepumpe.MP5 hadde det høyeste jernoksidinnholdet og var den eneste synlige partikkelen, så den ble brukt til å evaluere og karakterisere MP-atferd in vivo.
Plassering av magneten over luftrøret under MF-innsetting resulterte i at mange, men ikke alle, MF-er ble konsentrert i synsfeltet.Trakealinntrengning av partikler observeres best hos humant avlivede dyr.Figur 7 og tilleggsvideo S6: MP5 viser rask magnetisk fangst og justering av partikler på overflaten av den ventrale luftrøret, noe som indikerer at MP-er kan målrettes mot ønskede områder av luftrøret.Ved søk mer distalt langs luftrøret etter MF-levering, ble noen MF-er funnet nærmere karina, noe som indikerer utilstrekkelig magnetisk feltstyrke til å samle og holde alle MF-er, siden de ble levert gjennom området med maksimal magnetfeltstyrke under væskeadministrasjon.prosess.Postnatale MP-konsentrasjoner var imidlertid høyere rundt bildeområdet, noe som tyder på at mange MP-er forble i luftveisregioner der den påførte magnetiske feltstyrken var høyest.
Bilder av (a) før og (b) etter levering av MP5 i luftrøret til en nylig avlivet rotte med en magnet plassert rett over bildeområdet.Det avbildede området ligger mellom to bruskringer.Det er litt væske i luftveiene før MP leveres.Den røde boksen indikerer forstørrelsen som øker kontrasten.Disse bildene er hentet fra videoen i S6: MP5 Supplementary Video.
Flytting av magneten langs luftrøret in vivo resulterte i en endring i vinkelen til MP-kjeden på luftveisoverflaten, lik den som ble observert i kapillærer (se figur 8 og tilleggsvideo S7: MP5).I vår studie kunne imidlertid ikke parlamentsmedlemmer bli dratt langs overflaten av levende luftveier, slik kapillærer kan gjøre.I noen tilfeller forlenges MP-kjeden når magneten beveger seg til venstre og høyre.Interessant nok fant vi også at partikkelkjeden endrer dybden på overflatelaget til væsken når magneten beveges i lengderetningen langs luftrøret, og utvider seg når magneten flyttes rett over hodet og partikkelkjeden roteres til en vertikal posisjon (se Tilleggsvideo S7).: MP5 kl. 0:09, nederst til høyre).Det karakteristiske bevegelsesmønsteret endret seg når magneten ble flyttet sideveis over toppen av luftrøret (dvs. til venstre eller høyre for dyret, i stedet for langs lengden av luftrøret).Partiklene var fortsatt godt synlige under bevegelsen, men da magneten ble fjernet fra luftrøret, ble tuppene til partikkelstrengene synlige (se tilleggsvideo S8: MP5, starter kl. 0:08).Dette stemmer overens med den observerte oppførselen til magnetfeltet under påvirkning av et påført magnetfelt i en glasskapillær.
Eksempelbilder som viser MP5 i luftrøret til en levende bedøvet rotte.(a) Magneten brukes til å ta bilder over og til venstre for luftrøret, deretter (b) etter å ha flyttet magneten til høyre.Den røde boksen indikerer forstørrelsen som øker kontrasten.Disse bildene er fra videoen i S7s tilleggsvideo: MP5.
Når de to polene ble stilt inn i en nord-sør-orientering over og under luftrøret (dvs. tiltrekkende; fig. 3b), virket MP-akkordene lengre og var plassert på sideveggen av luftrøret i stedet for på den dorsale overflaten av luftrøret. luftrør (se vedlegg).Video S9:MP5).Høye konsentrasjoner av partikler på ett sted (dvs. den dorsale overflaten av luftrøret) ble imidlertid ikke oppdaget etter væskeadministrering ved bruk av en dobbelmagnetanordning, som vanligvis forekommer med en enkeltmagnetanordning.Da en magnet ble konfigurert til å frastøte motsatte poler (Figur 3c), økte ikke antallet partikler som var synlige i synsfeltet etter levering.Å sette opp begge to magnetkonfigurasjonene er utfordrende på grunn av den høye magnetiske feltstyrken som henholdsvis tiltrekker eller skyver magnetene.Oppsettet ble deretter endret til en enkelt magnet parallelt med luftveiene, men passerer gjennom luftveiene i en 90 graders vinkel slik at kraftlinjene krysset luftrørveggen ortogonalt (Figur 3d), en orientering ment å bestemme muligheten for partikkelaggregering på sideveggen.bli observert.I denne konfigurasjonen var det imidlertid ingen identifiserbar MF-akkumuleringsbevegelse eller magnetbevegelse.Basert på alle disse resultatene ble en konfigurasjon med en enkelt magnet og en 30-graders orientering valgt for in vivo studier av genbærere (fig. 3a).
Når dyret ble avbildet flere ganger umiddelbart etter å ha blitt ofret på en menneskelig måte, betydde fraværet av forstyrrende vevsbevegelser at finere, kortere partikkellinjer kunne skjelnes i det klare interbruskfeltet, "svingende" i samsvar med magnetens translasjonsbevegelse.tydelig se tilstedeværelsen og bevegelsen av MP6-partikler.
Titeren til LV-LacZ var 1,8 x 108 IE/ml, og etter blanding 1:1 med CombiMag MP (MP6), ble dyrene injisert med 50 µl av en luftrørsdose på 9 x 107 IE/ml LV-bærer (dvs. 4,5 x 106 TU/rotte).).).I disse studiene, i stedet for å flytte magneten under fødselen, festet vi magneten i én posisjon for å bestemme om LV-transduksjon kunne (a) forbedres sammenlignet med vektorlevering i fravær av et magnetisk felt, og (b) om luftveien kunne være fokusert.Cellene blir transdusert i de magnetiske målområdene i de øvre luftveiene.
Tilstedeværelsen av magneter og bruken av CombiMag i kombinasjon med LV-vektorer så ikke ut til å påvirke dyrehelsen negativt, og det samme gjorde vår standard LV-vektorleveringsprotokoll.Frontale bilder av luftrørsregionen utsatt for mekanisk forstyrrelse (Supplerende Fig. 1) viste at den LV-MP-behandlede gruppen hadde betydelig høyere transduksjonsnivåer i nærvær av en magnet (Fig. 9a).Bare en liten mengde blå LacZ-farging var til stede i kontrollgruppen (figur 9b).Kvantifisering av X-Gal-fargede normaliserte regioner viste at administrering av LV-MP i nærvær av et magnetisk felt resulterte i en omtrent 6 ganger forbedring (fig. 9c).
Eksempel på sammensatte bilder som viser trakeal transduksjon med LV-MP (a) i nærvær av et magnetfelt og (b) i fravær av en magnet.(c) Statistisk signifikant forbedring i det normaliserte området av LacZ-transduksjon i luftrøret ved bruk av en magnet (*p = 0,029, t-test, n = 3 per gruppe, gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet).
Nøytrale raske rødfargede seksjoner (eksempel vist i tilleggsfigur 2) indikerte at LacZ-fargede celler var tilstede i samme prøve og på samme sted som tidligere rapportert.
Nøkkelutfordringen i luftveisgenterapi er fortsatt den nøyaktige lokaliseringen av bærerpartikler i områder av interesse og oppnåelse av et høyt nivå av transduksjonseffektivitet i den mobile lungen i nærvær av luftstrøm og aktiv slimclearance.For LV-bærere beregnet for behandling av luftveissykdommer ved cystisk fibrose, har det hittil vært et uoppnåelig mål å øke oppholdstiden for bærerpartiklene i de ledende luftveiene.Som påpekt av Castellani et al., har bruken av magnetiske felt for å forbedre transduksjon fordeler i forhold til andre genleveringsmetoder som elektroporasjon fordi den kan kombinere enkelhet, økonomi, lokalisert levering, økt effektivitet og kortere inkubasjonstid.og muligens en lavere dose vehikel10.Imidlertid har in vivo avsetning og oppførsel av magnetiske partikler i luftveiene under påvirkning av eksterne magnetiske krefter aldri blitt beskrevet, og faktisk har denne metodens evne til å øke genekspresjonsnivåer i intakte levende luftveier ikke blitt demonstrert in vivo.
Våre in vitro-eksperimenter på PCXI-synkrotronen viste at alle partiklene vi testet, med unntak av MP polystyren, var synlige i bildeoppsettet vi brukte.I nærvær av et magnetfelt danner magnetiske felt strenger, hvis lengde er relatert til typen partikler og styrken til magnetfeltet (dvs. magnetens nærhet og bevegelse).Som vist i figur 10, dannes strengene vi observerer når hver enkelt partikkel blir magnetisert og induserer sitt eget lokale magnetfelt.Disse separate feltene får andre lignende partikler til å samle seg og koble seg til gruppestrengbevegelser på grunn av lokale krefter fra de lokale tiltreknings- og frastøtningskreftene til andre partikler.
Diagram som viser (a, b) kjeder av partikler som dannes inne i væskefylte kapillærer og (c, d) et luftfylt luftrør.Merk at kapillærene og luftrøret ikke er trukket i skala.Panel (a) inneholder også en beskrivelse av de MF-holdige Fe3O4-partiklene arrangert i kjeder.
Når magneten beveget seg over kapillæren, nådde vinkelen på partikkelstrengen den kritiske terskelen for MP3-5 som inneholder Fe3O4, hvoretter partikkelstrengen ikke lenger forble i sin opprinnelige posisjon, men beveget seg langs overflaten til en ny posisjon.magnet.Denne effekten oppstår sannsynligvis fordi overflaten av glasskapillæren er jevn nok til å tillate denne bevegelsen.Interessant nok oppførte ikke MP6 (CombiMag) seg på denne måten, kanskje fordi partiklene var mindre, hadde et annet belegg eller overflateladning, eller den proprietære bærervæsken påvirket deres evne til å bevege seg.Kontrasten i CombiMag-partikkelbildet er også svakere, noe som tyder på at væsken og partiklene kan ha samme tetthet og derfor ikke lett kan bevege seg mot hverandre.Partikler kan også sette seg fast hvis magneten beveger seg for raskt, noe som indikerer at magnetfeltstyrken ikke alltid kan overvinne friksjonen mellom partikler i væsken, noe som tyder på at magnetfeltstyrken og avstanden mellom magneten og målområdet ikke bør komme som en overraskelse.viktig.Disse resultatene indikerer også at selv om magneter kan fange opp mange mikropartikler som strømmer gjennom målområdet, er det usannsynlig at magneter kan stole på for å flytte CombiMag-partikler langs overflaten av luftrøret.Dermed konkluderte vi med at in vivo LV MF-studier skulle bruke statiske magnetiske felt for å fysisk målrette spesifikke områder av luftveistreet.
Når partiklene først er levert inn i kroppen, er de vanskelige å identifisere i sammenheng med det komplekse bevegelige vevet i kroppen, men deres deteksjonsevne har blitt forbedret ved å flytte magneten horisontalt over luftrøret for å "vrikke" MP-strengene.Mens sanntidsavbildning er mulig, er det lettere å skjelne partikkelbevegelser etter at dyret har blitt avlivet på en human måte.MP-konsentrasjoner var vanligvis høyest på dette stedet når magneten ble plassert over avbildningsområdet, selv om noen partikler vanligvis ble funnet lenger ned i luftrøret.I motsetning til in vitro-studier, kan ikke partikler bli dratt ned i luftrøret ved bevegelse av en magnet.Dette funnet stemmer overens med hvordan slimet som dekker overflaten av luftrøret typisk behandler inhalerte partikler, fanger dem i slimet og deretter fjerner dem gjennom slimhinne-clearance-mekanismen.
Vi antok at bruk av magneter over og under luftrøret for tiltrekning (fig. 3b) kunne resultere i et mer jevnt magnetfelt, snarere enn et magnetfelt som er sterkt konsentrert på ett punkt, noe som potensielt kan resultere i en mer jevn fordeling av partikler..Vår foreløpige studie fant imidlertid ikke klare bevis for å støtte denne hypotesen.Tilsvarende, å sette et par magneter til å frastøte (fig. 3c) resulterte ikke i at flere partikler satte seg i bildeområdet.Disse to funnene viser at dual-magnet-oppsettet ikke forbedrer den lokale kontrollen av MP-peking betydelig, og at de resulterende sterke magnetiske kreftene er vanskelige å justere, noe som gjør denne tilnærmingen mindre praktisk.På samme måte økte heller ikke antall partikler som var igjen i det avbildede området å orientere magneten over og over luftrøret (figur 3d).Noen av disse alternative konfigurasjonene vil kanskje ikke være vellykkede da de resulterer i en reduksjon i magnetfeltstyrken i avsetningssonen.Dermed regnes den enkle magnetkonfigurasjonen ved 30 grader (fig. 3a) som den enkleste og mest effektive in vivo-testmetoden.
LV-MP-studien viste at når LV-vektorer ble kombinert med CombiMag og levert etter å ha blitt fysisk forstyrret i nærvær av et magnetisk felt, økte transduksjonsnivåene betydelig i luftrøret sammenlignet med kontroller.Basert på synkrotronavbildningsstudier og LacZ-resultater, så magnetfeltet ut til å være i stand til å holde LV i luftrøret og redusere antall vektorpartikler som umiddelbart penetrerte dypt inn i lungen.Slike målrettingsforbedringer kan føre til høyere effektivitet samtidig som de reduserer leverte titere, ikke-målrettet transduksjon, inflammatoriske og immunologiske bivirkninger og genoverføringskostnader.Viktigere, ifølge produsenten, kan CombiMag brukes i kombinasjon med andre genoverføringsmetoder, inkludert andre virale vektorer (som AAV) og nukleinsyrer.